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高密度凍存研究 – 現貨型CAR-NK細胞




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臨床研究, 免疫細胞療法                                                                        ?
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間充質干細胞、免疫細胞、外泌體源頭實驗室




細胞凍存是細胞療法生產過程的最后一步也是及其重要的環節，凍存的細胞密度等參數直接關乎后續的制劑形式。


Fate Therapeutics針對其iNK產品做過如下研究，數據比較詳實，供參考：


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


一、iNK細胞高密度凍存


該研究篩選了多種iNK細胞產品的凍存保護劑，并測試了三種細胞密度，包括1.5E+07（標準細胞密度，STD）、5.6E+07（高細胞密度，HD1）和1.1E+08（特高細胞密度，HD2） viable cells/mL，測試樣本來自兩個不同的iNK產品，FT596（抗CD19 CAR）和FT536（抗MICA/B CAR），進行可行性和穩定性評估。


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


二、凍存保護劑篩選


將iNK細胞冷凍保存于10種凍存保護劑中，經過一段時間后復蘇


A.通過細胞計數（AO/DAPI）評估其存活率和恢復率


B.通過7-AAD和Annexin V染色評估細胞凋亡


C.細胞增殖測試


D.腫瘤靶向細胞殺傷測定（E/T比為3:1），顯示在細胞毒性曲線中


E.以3:1的E/T比下的曲線下面積（AUC）。


最終F10*被確定為最優凍存保護劑，并用于所有后續研究。


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


三、細胞存活率和CAR陽性率分析


A. 在37°C下復蘇后，HD-fill CAR-19和CAR-MICA/B iNK細胞的存活率與STD條件相當（單因素方差分析）。


B、C. 流式細胞術分析表明，在所有細胞凍存密度中，細胞具有高存活率和低凋亡率（7-AAD-Annexin V+）或低死亡率（7-AAD+）。


D. 細胞復蘇后的表型通過流式細胞術進行分析。NK細胞特征（CD45+CD56+）和轉基因（人類不可剪切CD16，hnCD16）以及嵌合抗原受體（CAR-19，CAR-MICA/B）的表達率均＞95%。


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


四、細胞殺傷功能分析


A. 利用CAR-19 iNK和NALM-6細胞系，在一系列E:T比例下，通過流式細胞術基于殺傷實驗來檢測CD19特異性細胞毒性。


B. 利用CAR-MICA/B iNK和CaSki細胞，在一系列E:T比例下，通過基于圖像的殺傷實驗來確定MICA/B特異性細胞毒性。


C. 來自HD-fill凍存的CAR-MICA/B iNK細胞在各種E:T比例下顯示出相對的ADCC效能。


D. 來自HD-fill凍存的CAR-MICA/B iNK細胞在一系列E:T = 10:1的腫瘤靶向再刺激實驗中保持強大的細胞毒性。


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


五、室溫放置后測試細胞活率和殺傷功能


A, B. 在室溫下保持5/60/90分鐘后，HD-fill CAR-19和CAR-MICA/B iNK細胞產品的細胞存活率與標準條件相當（細胞存活率變化通過雙向方差分析進行分析）。


C. 在室溫下保持90分鐘后，CAR-19和CAR-MICA/B iNK細胞保留NK特征和轉基因的表達。


D，E. 通過流式細胞術基于殺傷實驗分析HD-fill iNK細胞產品的效力，兩種NK產品均表現出一致的CAR介導的細胞殺傷。


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


六、細胞凍存穩定性研究


細胞在-80°C/-150°C存儲條件下至少穩定保持1個月。


A、D. 復蘇后細胞存活率，


B、E. 復蘇后凋亡率


C、F. 存儲在-80°C的CAR-19 iNK細胞的增殖能力與存儲在氣相液氮（


高密度凍存研究 - 現貨型CAR-NK細胞


七、結論


該研究展示了高密度CAR-iNK細胞可以穩定凍存在-80°C和


如果在臨床試驗中也能得到效果驗證的話，高密度凍存技術必將為免疫細胞療法提供更大的靈活性和可及性。


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