CAR-NK細胞治療CD19陽性淋巴腫瘤

嵌合抗原受體（CAR）已被用于改變T細胞的特異性，使其能夠針對許多血液系統癌癥，并取得了明顯的臨床效果。雖然自體CAR修飾T細胞具有抗腫瘤活性，但在安排統籌和臨床方面仍有一定的局限性。CAR T細胞是為個體患者制備，因此制備過程復雜且昂貴。一些患者接受CAR T細胞治療后伴發了顯著的毒性作用（包括細胞因子釋放綜合征和神經毒性，需要在專門的治療機構進行治療）。有效并且具有較好安全性的同種異體產品將可以克服這些局限性。

經過改造后表達CAR的自然殺傷（NK）細胞是癌癥治療的候選效應細胞。先天免疫系統的這些細胞可靶向下調HLA Ⅰ類分子或表達應激標志物的癌癥或病毒感染的細胞，并通過這一方式在免疫監視中發揮關鍵作用。同種異體（如來自臍帶血）NK細胞無需達到HLA完全匹配即可安全使用，因而無需為每例患者制備獨特的CAR產品。此外，同種異體NK細胞之前已用于癌癥患者的過繼免疫治療，并證明了安全性。

因此，為了利用NK細胞的抗腫瘤潛力進行臨床試驗，我們利用表達抗CD19 CAR、白細胞介素-15編碼基因的反轉錄病毒載體來促進轉導NK細胞的體內擴增和持續，并在發生無法接受的毒性作用時，利用可誘導型半胱天冬酶9來啟動CAR-NK細胞凋亡。

在小鼠淋巴瘤臨床前模型中，我們發現與未經轉導的對照NK細胞相比，來自臍帶血且轉導了抗CD19 CAR、白細胞介素-15和可誘導型半胱天冬酶9的NK細胞具有較好的抗腫瘤活性。

根據這些研究結果，我們開展了一項1期和2期試驗（在ClinicalTrials.gov注冊號為NCT03056339），目的是評估遞增劑量的CAR-NK細胞治療復發性或難治性CD19陽性腫瘤的安全性和療效。

研究設計和患者

此項試驗仍在進行中，我們在本文中報告了前11例患者，數據截止日期為2019年4月。簡單地說，患者連續3日接受每日氟達拉濱（劑量為30 mg/m2體表面積）和環磷酰胺（劑量為300 mg/m2）淋巴細胞清除性化療，之后單次輸入CAR-NK細胞（劑量遞增，每1kg體重1×105個細胞、1×106個細胞和1×107個細胞）。完成第30日評估后，可根據治療醫師的意見給予疾病緩解后的治療。

前9例患者接受了與受者HLA基因型部分匹配（在HLA位點A、B和DRβ1，6種HLA分子中的4種匹配）的CAR-NK產品（表1和補充附錄表S1）。之后我們對試驗方案進行了修訂，允許在不考慮HLA是否匹配的情況下進行治療；患者10和11的治療中采用了該操作。在可能的情況下，我們選擇了殺傷性免疫球蛋白樣受體（KIR）配體不匹配的一個單位臍帶血來制備CAR-NK（供者和受者之間的KIR不匹配有可能通過稱為缺失-自我識別的過程來增強NK細胞的固有[非CAR介導的]抗腫瘤活性）。我們依據2018年國際慢性淋巴細胞白血病研討會標準和2014年盧加諾非霍奇金淋巴瘤分類法確定患者對治療產生的應答。

從2017年6月至2019年2月，我們按照試驗方案納入了15例連續患者。其中4例患者在治療開始前退出，原因是疾病進展、發生移植物抗宿主病、無可檢測到的病變和產品發生細菌污染（各1例患者）。因此，11例患者接受了單劑CAR-NK細胞治療（表1）?；颊咧形荒挲g為60歲（范圍，47～70）。這11例患者已接受過的治療線數的中位數為4（范圍，3～11）。5例患者患CLL（包括發生Richter轉化或患加速期CLL 2例患者），這些患者均曾在接受依魯替尼+至少其他三線治療的情況下發生疾病進展；這5例患者均有高危遺傳特征。6例患者患淋巴瘤，包括2例彌漫性大B細胞淋巴瘤和4例濾泡樣淋巴瘤；其中3例患者轉化為高級別淋巴瘤。在6例淋巴瘤患者中，4例在自體造血干細胞移植后發生疾病進展，2例患難治性疾病。

安全性

輸入CAR-NK細胞后，沒有任何患者出現細胞因子釋放綜合征、神經毒性或噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥的癥狀。此外，雖然患者與其使用的CAR-NK產品存在HLA不匹配，但我們未觀察到移植物抗宿主病。正如預期的那樣，所有患者均發生了一過性、可逆的血液學毒性事件，主要與淋巴細胞清除性化療相關。

本研究中無腫瘤溶解綜合征或者3級或4級非血液學毒性病例。本研究未達到CAR-NK細胞的最大耐受劑量。表2列出了研究中觀察到的所有不良事件。沒有任何患者因治療與CAR-NK細胞相關的不良事件入住重癥監護病房（ICU）。然而，患者2因治療進展性淋巴瘤而入住ICU，隨后死亡。鑒于研究中未發現嚴重毒性，因此我們未（使用rimiducid）激活半胱天冬酶9安全開關來去除CAR-NK細胞。

治療應答情況

中位隨訪13.8個月（范圍，2.8～20.0）時，8例患者（73%）達到客觀緩解，其中7例達到完全緩解（3例CLL患者和4例淋巴瘤患者）。在CAR-NK輸入后30日進行的正電子發射斷層掃描-計算機斷層掃描（PET-CT）中，另外1例發生Richter轉化的CLL患者（患者5）未見氟脫氧葡萄糖攝取病變，但該患者仍有血細胞減少和CLL骨髓浸潤，我們據此判定該患者達到高級別淋巴瘤完全緩解（圖S2）。雖然該患者最終在接受緩解后治療期間達到完全緩解（見下文），我們未將這一緩解歸因于CAR-NK治療。所有8例緩解患者的疾病緩解均發生在輸入后1個月內。在接受治療的11例患者中，5例接受了KIR配體不匹配的產品治療。在如此小的病例系列中，我們無法評估KIR配體不匹配對結局的影響。?

疾病緩解后治療

在接受CAR-NK治療后達到緩解的8例患者中，5例接受了緩解后治療（圖1）?；颊?（患CLL）在輸入后9個月被發現微小殘留病變（外周血流式細胞術檢測結果），并接受了利妥昔單抗治療?；颊?（也患CLL）達到了臨床完全緩解，但有持續的微小殘留病變，并從輸入后6周開始接受免疫調節劑來那度胺治療?；颊?（轉為為濾泡性淋巴瘤）和患者11（患濾泡性淋巴瘤）接受CAR-NK治療后，在達到完全緩解并且無微小殘留病變證據的情況下接受了造血干細胞移植?；颊?（患CLL并發生了Richter轉化）達到了高級別淋巴瘤緩解，但CLL持續，并接受了維奈托克（venetoclax）治療。在撰寫本文前的最后一次評估日期，所有這些患者均存活并且完全緩解，但患者3、5和7的微小殘留病變結果仍呈陽性。

B細胞再生障礙

由于本研究將B細胞再生障礙用作抗CD19 CAR T細胞活性的替代指標，因此我們在輸入CAR-NK細胞后測定了患者外周血中的CD19陽性B細胞頻率。納入本研究時，除患者1和5之外，所有患者均有與之前B細胞耗竭治療相關的B細胞再生障礙?；颊?在CAR-NK治療和淋巴細胞清除性化療后發生了B細胞再生障礙?；颊?雖然在高級別轉化方面達到了完全緩解，但在接受venetoclax治療之前，外周血中的CLL持續?；颊?有B細胞恢復的證據，且時間與微小殘留病變陽性復發的時間重合。在隨訪期間，其余患者均未恢復正常的B細胞計數。?

CAR-NK擴增、遷移和持續

我們根據每μg基因組DNA中的載體轉基因拷貝數量，利用定量實時聚合酶鏈反應測定了CAR-NK細胞的體內擴增。細胞擴增最早在輸入后3日即可觀察到，CAR-NK細胞持續存在至少12個月（圖2A和表S3）。我們在輸入后3～14日測出峰值CAR-NK拷貝數，峰值CAR-NK拷貝數具有劑量依賴性。第14日之后，在外周血轉錄物水平或CAR-NK細胞持續性方面，我們未觀察到與劑量相關的差異。如在接受CAR-T細胞治療的患者中所觀察到的那樣，在本研究中，與治療后無緩解的患者相比，有緩解的患者有顯著較高水平的早期CAR-NK細胞擴增（圖2B）。我們未觀察到CAR-NK細胞的持續性，因為與受者HLA不匹配程度的不同而有差異（表1和圖S3）。我們利用流式細胞術證實了這些結果（圖S4）。

在采集了淋巴結樣本的2例患者中，淋巴結中的CAR-NK細胞數量超過骨髓或外周血（圖S5和S6），這一發現支持CAR-NK細胞向病變部位歸巢的觀點。在采集了骨髓和外周血樣本的10例患者中，骨髓和外周血檢出的CAR-NK細胞水平相似（圖S7）。

輸入后，產品中污染的表達CAR的極少T細胞未發生可檢出的CAR T細胞擴增，CD3+ T細胞也未導致移植物抗宿主病（圖S8）。在無緩解或復發的患者中，雖然腫瘤細胞有CD19表達，但仍可檢出低水平的CAR-NK細胞，這提示存在其他免疫逃避機制，如誘導CAR-NK耗竭。我們未對復發患者的殘留CAR-NK細胞進行功能研究。疾病復發時，持續的CAR-NK細胞未發生體內擴增。?

血清細胞因子分析

我們對連續外周血樣本上清液內的炎性細胞因子和白細胞介素-15進行了測定，白細胞介素-15由用于制備CAR-NK細胞的反轉錄病毒載體進行編碼。我們觀察到，與基線水平相比，炎性細胞因子（例如白細胞介素-6和腫瘤壞死因子α）水平未增加，白細胞介素-15的全身水平與治療前相比也未增加，這表明輸入CAR-NK細胞后，它未向外周血中釋放可導致全身水平明顯增加的白細胞介素-15（圖S9）。

對針對供者的同種免疫抗體應答的誘導作用

所有患者均接受了HLA不匹配的CAR-NK產品治療?；颊?至9接受了部分匹配（6種HLA分子中的4種匹配）的產品治療，患者10和11在不考慮HLA是否匹配的情況下接受了CAR-NK細胞治療。因此，我們監測了對供者特異性HLA抗體的誘導作用。在檢測的所有時間點，我們均未觀察到誘導產生針對輸入產品中不匹配HLA等位基因的抗體（表S4）。未評估宿主細胞應答。

我們在本文中給出了對NK細胞開展的1期和2期研究的早期結果，這些NK細胞來自臍帶血，并且經改造后可表達抗CD19 CAR、白細胞介素-15和可誘導型半胱天冬酶9安全開關。我們在既往接受過大量治療的多次復發性或難治性CLL或非霍奇金淋巴瘤的患者中對這種療法進行了檢驗（表1）。中位隨訪13.8個月時，在接受治療的11例患者中，8例（73%）達到了客觀緩解（5例CLL患者中的4例和6例非霍奇金淋巴瘤患者中的4例），11例患者中有7例（64%）達到了完全緩解?；颊哌_到緩解的速度快，且見于所有劑量水平。

在腫瘤過繼免疫治療后，未經改造的NK細胞一般到輸入后2周已消失，這一特性限制了其臨床應用。本研究發現輸入的CAR-NK細胞發生擴增，并以低水平持續存在至少12個月，盡管輸入的NK細胞和受者之間存在顯著的HLA不匹配。細胞構造中納入的白細胞介素-15可能在這些CAR-NK細胞的持續性和抗腫瘤活性中發揮重要作用。

受者未對CAR-NK細胞產生排斥可能有幾方面原因。在我們的研究中，HLA不匹配CAR-NK細胞的長期持續存在很可能是由以下兩方面介導：淋巴細胞清除性化療方案產生了寬容的環境，以及CAR-NK細胞對白細胞介素-15的異位表達（這會促進轉導細胞的擴增和持續存在）。然而，持續存在的細胞不足以阻止疾病復發，并且復發似乎未導致細胞的后續體內擴增。

我們發現，異體CAR-NK細胞可采用過繼轉移的方式用于患者，而不會出現嚴重細胞因子釋放綜合征及與CAR T細胞治療相關的神經毒性作用。然而，我們觀察到了一過性的高級別骨髓毒性，這可歸因于淋巴細胞清除性化療。我們無法評估CAR-NK細胞是否導致了骨髓毒性。雖然CAR-NK細胞和受者之間存在顯著的HLA不匹配，但未觀察到移植物抗宿主病，這一發現與異體NK細胞的臨床前研究和臨床研究結果一致。雖然CAR-NK細胞產品含有一些供者T細胞，但這些細胞的數量明顯不足以啟動移植物抗宿主病途徑。

目前認為CAR T細胞的毒性作用（如細胞因子釋放綜合征）主要是由CAR T細胞和髓系細胞分泌的白細胞介素-6介導。NK細胞分泌的白細胞介素-6比T細胞少。另外，NK細胞與髓室（myeloid compartment）之間的交互應答（cross-talk）與T細胞不同。在我們整個研究期間，炎性細胞因子（如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子α和干擾素γ）穩定在低水平。

目前FDA批準的包含CAR T細胞的產品都是針對個體患者（自體），因此制備過程復雜而昂貴。本研究序貫納入患者，最短間隔時間為2周，以確保安全性。因此，我們為每例患者制備了新鮮的CAR-NK細胞產品。然而，我們已經證明，有可能通過一單位臍帶血制備出超過100劑CAR-NK細胞。這一制備能力，以及對于CAR-NK細胞供者與患者很低的HLA匹配要求，有可能為真正的現成產品鋪平道路，從而使得更多的患者獲得治療。這一可能性尚未得到證實，因為目前尚無任何患者接受凍存后又融化的CAR-NK細胞并證明其抗腫瘤活性。目前我們不能確定緩解的持久性，這是限制我們就其療效得出結論的另一個因素。然而，我們的初步結果表明，CAR-NK細胞可誘導高危CD19陽性腫瘤患者達到緩解，且除一過性的骨髓毒性之外，其他不良事件相對較少。