T細(xì)胞的不同亞群及其在CAR-T免疫療法中的作用

編輯：沈乾 亂步江南

目前絕大多數(shù)的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品是表達(dá)CAR的T細(xì)胞混合群體，因此，T細(xì)胞的不同亞群及其在CAR-T免疫療法中的作用，一直是細(xì)胞治療關(guān)心的問題。

2016年3月，《癌癥》期刊發(fā)布了題為“Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy”的綜述，介紹了T細(xì)胞不同亞群的基礎(chǔ)知識，并總結(jié)了它們在CAR-T療法中的作用，包括CD4+/CD8+細(xì)胞亞群和分化、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞功能、T細(xì)胞的生物標(biāo)志物、T細(xì)胞的代謝信號通路等。雖然距離文章的發(fā)布已經(jīng)過去較長時間，但其中的一些內(nèi)容還是會帶給人很多啟示，“細(xì)胞知聊”本期將詳細(xì)介紹該綜述文章。

CAR-T是具有抗原特異性和T細(xì)胞效應(yīng)或調(diào)節(jié)功能、表達(dá)基于抗體的嵌合受體的T細(xì)胞，由Eshhar及其同事在1980年代首次描述(以色列魏茨曼科學(xué)研究所)。CAR結(jié)構(gòu)中包含抗體的單鏈可變片段(scFv)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激結(jié)構(gòu)域(CD28、CD137(4-1BB)或其他)和激活結(jié)構(gòu)域CD3 zeta(圖1)。一旦CAR-T與腫瘤抗原結(jié)合，T細(xì)胞擴(kuò)增就會被激活，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

研究報道指出T細(xì)胞亞群(記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞)在個體患者T細(xì)胞之間功能的差異，對CAR-T細(xì)胞免疫療法的療效具有重要提示。例如，高表達(dá)CD62L、CD95和CCR-7的CD45RA+的干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞(TSCM)，被證明比中央記憶T細(xì)胞(TCM)能更持久有效地對抗腫瘤，即抗腫瘤T細(xì)胞的干性可以增加免疫治療的潛力。

因此，T細(xì)胞的分化亞群、T細(xì)胞的干細(xì)胞樣、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞功能的詳細(xì)機(jī)制，對于提高CAR-T的抗腫瘤療效非常重要。已經(jīng)有CD4+ CAR-T和CD8+ CAR-T細(xì)胞及其抗腫瘤活性的比較報道，提示可能將用于設(shè)計改進(jìn)具有更強(qiáng)療效的下一代CAR-T細(xì)胞；也有報道表明，當(dāng)混合CD4+和CD8+ CD19 CAR-T細(xì)胞亞群，得到最佳比例時，可以在體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。

T細(xì)胞在胸腺中成熟，表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)，其表面表達(dá)CD8糖蛋白時，稱為CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞毒T細(xì)胞)；或表達(dá)CD4糖蛋白時，則稱為CD4+T細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)。CD4+T細(xì)胞又分化成不同的亞群：Th(T輔助細(xì)胞)1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)和Tfh(濾泡輔助性T細(xì)胞)，其特征在于表達(dá)不同的細(xì)胞因子譜(圖2)，這些不同的CD4+亞群在T細(xì)胞的免疫和效應(yīng)反應(yīng)功能中，發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

所有CD4+Th亞群都通過特定細(xì)胞因子從幼稚CD4+T細(xì)胞分化而來：Th1通過IL-12和IFN-γ(促炎細(xì)胞因子，具有多種作用，例如增加Toll樣受體TLR、誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌或巨噬細(xì)胞活化)、Th2通過IL-4、Treg通過IL-2和TGF-β分化產(chǎn)生(圖2)。

同時，每個Th亞群都會釋放特定的細(xì)胞因子，發(fā)揮促炎癥或抗炎癥、生存、或保護(hù)功能。例如，Th1釋放IFN-γ和TNF；Th2釋放IL-4(B淋巴細(xì)胞的重要生存因子)、IL-5和IL-13；Th9產(chǎn)生IL-9；Treg分泌IL-10(一種具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，維持Treg對其他細(xì)胞的抑制功能所需的FOXP3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá))和TGF-β；Th17產(chǎn)生IL-17(一種在宿主防御細(xì)菌和真菌中起重要作用的細(xì)胞因子)。

T細(xì)胞分化、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞在針對病原體的免疫中發(fā)揮著重要作用。CD4+細(xì)胞從幼稚T細(xì)胞、到效應(yīng)或記憶T細(xì)胞、和中央記憶T細(xì)胞的分化示意圖見圖3，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)也會表現(xiàn)出效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞呈遞給幼稚T細(xì)胞致病性抗原時，T細(xì)胞會被激活同時細(xì)胞數(shù)量增加，分化為遷移到感染部位并殺傷病原體的效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞是短時間存在的細(xì)胞，而記憶細(xì)胞具有長期存活的潛力(圖3)。

CD8+T細(xì)胞的不同亞群見圖4，幼稚T細(xì)胞可以分化成T細(xì)胞干細(xì)胞記憶細(xì)胞(TSCM)、T細(xì)胞中央記憶細(xì)胞(TCM)、T細(xì)胞效應(yīng)記憶細(xì)胞(TEM)和T細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞(TEFF)。CD8+T細(xì)胞分化時效應(yīng)功能增加，而記憶功能和增殖減少，細(xì)胞分化時不同的CD8+生物標(biāo)志物包括L-選擇素、CD45RO、CD45RA、和CCR-7。

幼稚細(xì)胞最常見的細(xì)胞外表型標(biāo)志物是CD45RA+、CD45RO-；CD25+(Treg細(xì)胞)、CD62L+(L-選擇素+)、CCR-7+(圖3和圖4)。CD8+TEM細(xì)胞中這些標(biāo)記物變?yōu)?/span>CD45RA-；CD62L-、CCR-7-(圖4)。因此，在針對病原體或癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)期間，基于這些表型生物標(biāo)志物，可以將細(xì)胞亞群進(jìn)行分類、擴(kuò)增、并分析其功能活性。

幼稚T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的代謝途徑不同。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)被分解以產(chǎn)生能量時，靜息的幼稚T細(xì)胞或記憶細(xì)胞會進(jìn)行分解代謝，而當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)用于構(gòu)建分子復(fù)合物和基礎(chǔ)以支持細(xì)胞增殖時，活化的T細(xì)胞會進(jìn)行合成代謝。在分化和激活過程中，代謝從氧化磷酸化(OXPHOS)轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>糖酵解，活化細(xì)胞中合成代謝途徑的主要參與者是哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。?

活化T細(xì)胞中的IL-2和共刺激CD28信號，通過激活PI3激酶和下游AKT，誘導(dǎo)糖酵解(圖5)。同時，活化的AKT誘導(dǎo)mTOR通路并增加葡萄糖和氨基酸的利用，以支持活化T細(xì)胞的增殖。活躍增殖的CD4+和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞，依賴于有氧糖酵解從葡萄糖衍生的丙酮酸并產(chǎn)生乳酸，而記憶T細(xì)胞的代謝途徑不同，依賴于脂肪酸氧化。

CAR-T療法的挑戰(zhàn)之一，是改造T細(xì)胞使其具有抑制腫瘤信號，并對Treg細(xì)胞具有抗性，增加T細(xì)胞效應(yīng)和記憶功能，以增強(qiáng)針對腫瘤的免疫反應(yīng)。已經(jīng)有多個臨床前模型，證明了CAR-T治療時不同T細(xì)胞亞群的優(yōu)勢。如CD8+CD45RA+CCR7+ CAR-T細(xì)胞具有最接近T記憶干細(xì)胞的表型和更強(qiáng)的抗腫瘤活性。而在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、以及B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，由體外分別擴(kuò)增的CD8+和CD4+T細(xì)胞亞群，通過1:1比例組成的CD19-CAR-T細(xì)胞，具有高抗腫瘤活性。?

另一個需要考慮的方面是，患者的T細(xì)胞譜不同于健康人，并且在患者之間存在差異，這表明需要個體化T細(xì)胞亞群分析和個體化免疫療法，來有效治療癌癥。下一代測序、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，允許創(chuàng)建患者的個體化免疫譜，并檢測可以改善CAR-T治療的重要T細(xì)胞(圖6)。

已有報道表明，CD4+ Treg細(xì)胞可以浸潤到實體瘤中并降低CAR-T的療效。存在Treg細(xì)胞的情況下，CD28-CD3ζ CAR-T細(xì)胞對CEA過表達(dá)腫瘤的殺傷活性低于CD3ζ-CAR-T細(xì)胞，這是由于CD28-CD3ζ CAR-T細(xì)胞比CD3ζ-CAR-T細(xì)胞更有效地誘導(dǎo)Treg細(xì)胞浸潤到腫瘤中。敲除與IL-2產(chǎn)生相關(guān)的CD28結(jié)構(gòu)域內(nèi)的lck結(jié)合域，可以逆轉(zhuǎn)Treg導(dǎo)致的腫瘤浸潤，并增加CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。這與高劑量的IL-2給藥，會增加黑色素瘤癌癥患者中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的數(shù)量一致，而CD4+Foxp3+細(xì)胞對過繼免疫治療有負(fù)面影響。因此，降低Treg抑制活性并增加CAR-T細(xì)胞的持久性和抗性，以及CAR-T共刺激域的結(jié)構(gòu)和基因工程改造，可能是提高CAR-T免疫療法抗腫瘤功效的潛在方法之一(圖6)。?

在效應(yīng)Treg細(xì)胞中表達(dá)的另一種抑制標(biāo)記物是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)，在臨床前研究中已知它會阻斷免疫反應(yīng)并降低CAR-T的功效。用抗體或小分子阻斷CTLA-4或程序性細(xì)胞死亡蛋白1( PD-1)等免疫檢查點，是提高CAR-T免疫療法療效的另一種潛在方法。?

在開始CAR-T治療之前，使用氟達(dá)拉濱和/或環(huán)磷酰胺的患者進(jìn)行清淋，會減少外周T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的數(shù)量。清淋通過減少與預(yù)先存在的T細(xì)胞進(jìn)行IL-7和IL-15的競爭，來誘導(dǎo)過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的增殖。最近的臨床試驗也證明了清淋方法在改善CAR-T免疫療法方面的功效。?

另一種潛在的方法是通過影響CAR-T細(xì)胞代謝，增加效應(yīng)細(xì)胞功能，比如通過將細(xì)胞的分解代謝轉(zhuǎn)換為合成代謝(圖6)。靶向T細(xì)胞代謝可能通過促進(jìn)TEFF細(xì)胞的糖酵解代謝途徑來刺激免疫，或通過促進(jìn)Treg細(xì)胞亞群的脂質(zhì)氧化特征來抑制免疫和炎癥。最近研究表明，CAR的共刺激結(jié)構(gòu)域4-1BB或CD28，在調(diào)節(jié)CAR-T的特定代謝途徑和記憶功能方面具有不同的作用。4-1BB結(jié)構(gòu)域刺激CD8+中樞記憶T細(xì)胞的生長，可以提高呼吸能力、增加脂肪酸氧化、和增強(qiáng)線粒體生物合成；而CD28結(jié)構(gòu)域可以誘導(dǎo)生成具有強(qiáng)化糖酵解功能的效應(yīng)記憶細(xì)胞。(圖6)?

調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的組合也可以改變T細(xì)胞的分化狀態(tài)。例如，IL-12與IL-7或IL-21組合處理3天，與不加IL-12相比，T細(xì)胞表型的分化程度較低(CD62L+、CD28+、CD27+、CD127+、CCR-7+)，并且導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)，如Nanog、SOX-2、Oct-4和LIN28A。用IL-7+IL-15或IL-15+IL-21預(yù)處理T細(xì)胞，可以增加記憶T細(xì)胞功能和CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。IL-15已被證明可以增加CD8+T記憶細(xì)胞功能和增加T細(xì)胞抗腫瘤活性。與使用IL-2擴(kuò)增的CAR-T相比，使用IL-7+IL-15擴(kuò)增的CAR-T細(xì)胞具有更高的體內(nèi)存活率。因此，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素的組合可以影響T細(xì)胞的記憶功能，這可以作為增加CAR-T免疫療法療效的潛在方法(圖6)。

?由于CAR-T療法從患者中獲取用于擴(kuò)增的T細(xì)胞，因此分析CD4/CD8的比值，記憶細(xì)胞標(biāo)志物如CD45RA、CD45RO，和其他生物標(biāo)志物如CD26、CD95、CCR-7和CD62L，有助于選擇不同比例的T細(xì)胞亞群，以實現(xiàn)更有效和個性化的治療，為免疫治療提供新的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]?Golubovskaya V, Wu L. Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy. Cancers (Basel). 2016 Mar 15;8(3):36.