關(guān)于CAR-NK細(xì)胞療法，從六個(gè)維度分析

自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK細(xì)胞?)，是一類先天淋巴細(xì)胞，具有識(shí)別和消除病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的能力。隨著CAR-T細(xì)胞療法取得了顛覆性成功，大家對(duì)NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫療法中的潛力也興趣倍增。

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自從CAR-T療法上市后，CAR-NK細(xì)胞療法如雨后春筍般迎來(lái)投資狂熱，各大細(xì)胞企業(yè)或相關(guān)企業(yè)紛紛布局。然而，臨床推進(jìn)似乎并不像CAR-T細(xì)胞療法一樣順利。CAR-T細(xì)胞療法的經(jīng)驗(yàn)依然值得CAR-NK細(xì)胞療法借鑒，但是機(jī)制帶來(lái)的差異也需要解決。

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關(guān)于CAR-NK細(xì)胞療法，筆者有六點(diǎn)要談：

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–01–

病毒載體與轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇

目前，獲批用于商業(yè)用途的八款CAR-T產(chǎn)品，都是使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)的，由于GVHD的風(fēng)險(xiǎn)，僅用于自體使用。其中，水皰性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒是生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞最常用的偽分型受體。

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與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，基于慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)更安全，因?yàn)榫哂休^低的遺傳毒性和插入誘變。通常，原代NK細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率較低，通常需要多輪轉(zhuǎn)導(dǎo)。

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同時(shí)，CAR-NK細(xì)胞療法的GVHD風(fēng)險(xiǎn)很小。但是，其低密度脂蛋白受體的表達(dá)水平也很低，而這是VSV-G的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。因此，需要選擇NK細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性的載體。

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目前認(rèn)為，狒狒包膜偽型慢病毒載體（BaEV-LV）可顯著提高NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。此外，通過(guò)類病毒顆粒運(yùn)送CRISPR基因組編輯成分，也逐漸成為熱門(mén)的方法。轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR和基因敲除可以共同進(jìn)行。

Mol Ther Methods Clin Dev.

電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等轉(zhuǎn)染方法，也被用于將外源基因遞送到NK細(xì)胞中。目前，著名的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括PiggyBac和睡美人等。與病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)更快，細(xì)胞凋亡水平更低，個(gè)體間變異性更小，基因轉(zhuǎn)移效率更高有關(guān)。

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不過(guò)，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在轉(zhuǎn)導(dǎo)原代NK細(xì)胞中的適用性，仍需要進(jìn)一步修改，以克服轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低和質(zhì)粒DNA電穿孔對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)等問(wèn)題。

–02–

CAR-NK細(xì)胞的持久性

CAR-NK細(xì)胞持久性不如CAR-T細(xì)胞，這是NK細(xì)胞療法臨床療效有限的原因之一。目前認(rèn)為，短期接觸IL-12、IL-15和IL-18可產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的記憶樣NK細(xì)胞。

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臨床前預(yù)處理，也是CAR-NK細(xì)胞臨床應(yīng)用持久性的影響因素之一。通常，在接受CAR-NK細(xì)胞治療之前使用氟達(dá)拉濱/環(huán)磷酰胺的組合，以減少宿主對(duì)NK細(xì)胞的排斥反應(yīng)，重新編程免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并降低腫瘤負(fù)擔(dān)。

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細(xì)胞劑量上，在過(guò)繼轉(zhuǎn)移未經(jīng)修飾的NK細(xì)胞療法之前，高劑量方案能夠更好地使體內(nèi)NK細(xì)胞的擴(kuò)張和持久性滿足需求，而低劑量方案不能。

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不過(guò)，持久性要到什么程度才合適？

是越長(zhǎng)越好嗎？

也不盡然。

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目前認(rèn)為，僅需要在特定的腫瘤中強(qiáng)調(diào)增強(qiáng)NK細(xì)胞的持久性。CAR-T細(xì)胞療法的經(jīng)驗(yàn)表明，在比如淋巴瘤等類型中，患者可以在不延長(zhǎng)CAR-T持續(xù)時(shí)間的情況下產(chǎn)生持久的反應(yīng)。這或許是CAR-NK細(xì)胞可以借鑒的。

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到目前為止，優(yōu)化NK細(xì)胞CAR結(jié)構(gòu)的目標(biāo)大多集中在提高細(xì)胞毒性上，而非持久性。CAR-NK的低免疫原性，還使其能夠通過(guò)多次給藥來(lái)彌補(bǔ)持久性問(wèn)題。

–03–

CAR-NK細(xì)胞的遷移能力

CAR-T細(xì)胞改善其遷移能力（Trafficking）的途徑包括：通過(guò)CAR設(shè)計(jì)表達(dá)趨化因子受體、聯(lián)合給藥、改變給藥途徑等。這三種策略對(duì)CAR-NK細(xì)胞都有用。

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NK細(xì)胞本身在正常免疫中就使用趨化因子信號(hào)，經(jīng)修飾表達(dá)CXCR2、CXCR4、CCR5或CCR7的NK細(xì)胞，均被證明能增強(qiáng)小鼠的遷移功能，同時(shí)增強(qiáng)其抗腫瘤能力。但是并不影響其產(chǎn)生細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的程度和NK細(xì)胞的直接腫瘤殺傷活性。

Sig Transduct Target Ther.

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–04–

CAR-NK細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝

營(yíng)養(yǎng)代謝主要是針對(duì)實(shí)體瘤的適應(yīng)癥。在腫瘤微環(huán)境中，相當(dāng)多的營(yíng)養(yǎng)代謝屏障阻礙了免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，包括：缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、低pH值和各種代謝產(chǎn)物水平升高。

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具有優(yōu)化代謝功能的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，如有更高的氧化磷酸化，已被證明在臨床上更有效。例如在CLL患者中，CD8+T細(xì)胞在刺激后表現(xiàn)出受損的激活和葡萄糖攝取減少，長(zhǎng)期暴露影響代謝穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致刺激時(shí)代謝重編程異常。CLL衍生的CD8+T細(xì)胞在受到刺激時(shí)顯示出線粒體生物發(fā)生受損。

Blood

改善代謝的策略包括：

• 通過(guò)在體外擴(kuò)增過(guò)程中直接操縱細(xì)胞代謝；
• 基因工程改造T細(xì)胞。NK細(xì)胞也適用。

例如，采用mIL-21在體外擴(kuò)增NK細(xì)胞和CAR-NK細(xì)胞的研究顯示：擴(kuò)增所得的與富集代謝途徑相關(guān)的NK細(xì)胞分化程度較低，未耗盡表型、記憶樣表型的比例提高，并能抑制CAR-NK細(xì)胞的“自相殘殺”。

Mol Ther Methods Clin Dev.

NK細(xì)胞比T/B細(xì)胞更容易受到腫瘤微環(huán)境中過(guò)氧化氫的影響。有研究通過(guò)基因改造NK細(xì)胞使其過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物還原蛋白-1（PRDX1），該細(xì)胞在氧化應(yīng)激下對(duì)乳腺癌細(xì)胞顯示出有效的抗腫瘤活性。

Cancer Immunol Res.

–05–

腫瘤抗原丟失的影響

CAR-T細(xì)胞目前的探索包括：

• 設(shè)計(jì)雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞；
• 不同CAR的CAR-T細(xì)胞順序給藥；
• 聯(lián)合溶瘤病毒給藥。

不同于CAR-T細(xì)胞，NK細(xì)胞能夠通過(guò)先天受體（NCR、CD16、DNAM-1或NKG2D/DAP10等），在CAR抗原丟失或者下調(diào)的腫瘤逃逸環(huán)境中保留非CAR依賴性殺傷能力。

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此外，雙靶點(diǎn)CAR-NK細(xì)胞目前也有臨床前開(kāi)發(fā)，例如包含具有NKG19D跨膜和2B2/CD4ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域的CD3靶向CAR表達(dá)。

Blood

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–06–

胞啃作用的影響

胞啃作用（Trogocytosis）：信號(hào)傳導(dǎo)影響、抗原丟失、自相殘殺。

Frontiers in Immunology

▉?胞啃作用的積極影響：

通過(guò)胞啃作用，NK細(xì)胞可以獲得趨化因子受體（如CCR5、CXCR4、CCR7或TYRO3等）。CCR7的獲得，增強(qiáng)了NK細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)的能力，而TYRO3則提高了效應(yīng)器的功能和增殖水平。

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▉?胞啃作用的抑制影響：

通過(guò)胞啃作用，CAR-NK細(xì)胞可獲得免疫抑制蛋白來(lái)抑制其細(xì)胞毒作用。例如：在白血病環(huán)境中，NK細(xì)胞能從白血病細(xì)胞上獲得PD-1；在卵巢癌中，NK細(xì)胞從卵巢癌細(xì)胞上獲得CD9，抑制細(xì)胞毒作用。克服胞啃作用介導(dǎo)的信號(hào)傳遞是使用針對(duì)目標(biāo)抗原的封閉抗體。例如在卵巢癌中，有研究通過(guò)在CD9的情況下，使用CD9阻斷抗體在體外恢復(fù)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

Cell Rep.

▉? 胞啃作用與靶細(xì)胞抗原丟失

胞啃作用的另一個(gè)后果是靶細(xì)胞抗原丟失。雖然這已經(jīng)在CAR-NK細(xì)胞中顯示出來(lái)，但它在CAR-T細(xì)胞中得到了更多的研究。由于抗原密度影響CAR的功能，靶抗原的下調(diào)或內(nèi)化可導(dǎo)致腫瘤逃逸。因此，克服胞啃引起的抗原丟失可以提高腫瘤的清除率。

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第一種方法是通過(guò)調(diào)整CAR與靶抗原的親和力。低親和力結(jié)構(gòu)被認(rèn)為能在保持療效的同時(shí)減少了胞啃作用。在CAR-T細(xì)胞療法中已有臨床前研究證明，低親和力的CD19 CAR-T細(xì)胞能夠顯著限制胞啃作用，同時(shí)保持抗腫瘤活性和臨床療效。

?Leukemia

另一種方法是調(diào)整CAR的信號(hào)域。因?yàn)榘凶饔靡驯蛔C明在不同程度上影響具有CD28或4-1BB信號(hào)域的CARs。不過(guò)這種機(jī)制的影響效果差異很大，主要取決于抗原密度。

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胞啃作用使抗原轉(zhuǎn)移到NK細(xì)胞的最終結(jié)果是，介導(dǎo)了NK細(xì)胞對(duì)其他NK細(xì)胞的殺傷。在內(nèi)源性T細(xì)胞或NK細(xì)胞的抗原（如CD7或CD38）的背景下，敲除效應(yīng)細(xì)胞中的靶抗原可以克服同胞殺傷，但這種方法不適用于通過(guò)胞啃轉(zhuǎn)移到效應(yīng)細(xì)胞的抗原。

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–07–

小結(jié)和未來(lái)展望

說(shuō)不熱門(mén)吧，CAR-NK在血液瘤和實(shí)體瘤中均有不少企業(yè)布局。2023年5月6日，國(guó)家藥品審評(píng)中心（CDE）受理了啟函生物的同種異體CD19 CAR-NK的IND申請(qǐng)；

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說(shuō)熱門(mén)吧，不少備受關(guān)注的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品則臨床遲遲沒(méi)能推進(jìn)。行業(yè)先鋒的Fate還在2023年1月5日宣布與強(qiáng)生的合作終止，同時(shí)選擇聚焦開(kāi)發(fā)第二代CD19 CAR-NK療法，終止開(kāi)發(fā)FT596項(xiàng)目。

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這正是表明，CAR-NK細(xì)胞結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)上的迭代需求和技術(shù)，都已經(jīng)趕上了實(shí)際臨床試驗(yàn)的推進(jìn)進(jìn)度。這也給后來(lái)的企業(yè)更多的機(jī)會(huì)，通過(guò)技術(shù)彎道超車，未嘗不可實(shí)現(xiàn)。

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參考資料：

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