CAR-T療法毒副作用的生物學基礎

CAR-T療法在B細胞腫瘤方面表現出最高的療效。盡管急性淋巴細胞白血?。ˋLL，在大型試驗中高達94%）的完全緩解率很高，但在其中一項試驗（I 期，CTL019，見表1）中6個月時的無事件生存率為67%，在1-24個月（中位數為7個月）的隨訪期內，19名患者報告了持續緩解。大多數患者（19名中的15 名）未接受進一步治療。

值得注意的是，Lee等人和Davila等人報告的結果，在ALL的背景下，沒有評估治療的治愈潛力，因為大多數患者進行了同種異體造血干細胞移植（allo -HSCT) 后達到完全緩解(CR)。最新文章提高了我們對長期結果的理解，報告 18個月的總生存率為52%（ZUMA-1，中位隨訪時間為15.4個月；42%的PTS 顯示穩定反應）和76%在12個月（ELIANA，中位隨訪時間為13.1個月）。在最長 29 個月的中位隨訪（范圍：1-65）中，Park 等人(n=53, ALL) 報告的中位無事件生存期為6.1個月（95% CI：5.0-11.5），其中中位總生存期為12.9個月（95% CI：8.7-23.4）。重要的是，高疾病負擔（定義為≥5% 的骨髓原始細胞或髓外疾病）導致長期預后顯著更差。

在復發性或難治性急性髓系白血病(AML)中，結果也非常有希望，盡管缺乏正常造血祖細胞不表達的“理想”AML特異性靶標可能會限制CAR-T方法的范圍。BCMA特異性CAR-T療法在經過大量預處理的多發性骨髓瘤(MM)患者中的最新結果顯示出特別令人鼓舞的結果。在該試驗中，觀察到95% CR/接近CR，中位隨訪時間為6個月，盡管沒有關于長期生存的數據。

與血液系統惡性腫瘤相比，CAR-T細胞對實體癌的療效要低得多。迄今為止，已經報道了CAR-T治療實體瘤的最佳結果，用于治療HER2陽性肉瘤，17個PTS中有4個實現了疾病穩定。此外，11名神經母細胞瘤患者中有3名顯示CR，其中兩名顯示延長的CR19。

盡管 CAR-T 療法在治療 B 細胞惡性腫瘤方面取得了巨大成功，但這種療法仍存在嚴重的副作用。如下所示，我們將詳細介紹這些不良反應，并概述目前用于緩解這些并發癥的臨床方法。

CAR-T療法具有獨特的毒性特征，不容易預測和評估，因為在使用不同的 CAR-T設計時可能會有所不同。因此，一些試驗（例如NCT01236573、NCT01457131和NCT02535364）提前終止的原因是意外的毒性。雖然這是一個障礙，但許多優秀的研究正在進行中，以期克服這一障礙。

細胞因子釋放綜合征(CRS)

CRS是納入CAR-T細胞療法的試驗中最常見的不良事件（在抗 CD19環境中為74-100%）。這種并發癥被認為是由于CAR-T細胞的擴增和激活導致許多免疫細胞類型大量過量產生細胞因子，從而導致全身炎癥反應升高。

CRS的臨床表現

如圖2所示，CRS的臨床癥狀可以從輕微（發燒、肌痛、疲勞和輕度低血壓）到嚴重癥狀，例如需要血管加壓藥的低血壓、呼吸衰竭、凝血功能障礙和多器官系統衰竭。CRS可在CAR-T輸注后的第一周內出現，并在1-2周內進一步進展。發燒通常是CRS的第一個也是最必然的跡象?；加懈鼑乐谻RS的患者會更早出現發熱，發熱時間延長且體溫峰值較高。因此，“發熱時間”及其峰值已在CRS預測量表中得到充分利用。

CRS分級

為了及時有效的CRS管理，最近引入了準確和強大的臨床分級量表，每個都有細微的差異，它們都將CRS從僅需要對癥處理的1級毒性分類到可能危及生命的4級毒性，以及5級，其中致命的并發癥是明顯的。在臨床經驗中，4-5級CRS被稱為“嚴重 CRS”（sCRS）。

而 CRS 的分級起源于美國國家癌癥研究所不良事件通用術語標準（CTCAE v4.03），然后Lee等人提出了更新的分級，最后是MD Anderson Cancer Center CAR-T Therapy-Associated Toxicity Working開發了組(CARTOX) 分級。Lee等人根據他們的分級系統提供了治療指南，該分級系統在整個試驗中最常用。盡管CARTOX 量表似乎與Lee等人的量表幾乎相同，但它確實具有更易于使用的優點（表 2）。

CRS的發病機制

驅動CRS的第一個事件是CAR-T細胞的靶標依賴性激活，它釋放效應細胞因子，如IFNγ、TNFα和IL2。這些分子反過來能夠激活巨噬細胞，產生廣泛的促炎細胞因子，導致高細胞因子血癥和CRS的進展。在CAR相關CRS期間，三種最顯著升高的細胞因子是IL6、IFN-γ和IL10。與“無CRS”案例相比，他們的 CRS等級≥4 級增加了約2-3個日志。IL6水平升高與sCRS的關鍵臨床特征相關（包括缺氧、低血壓、凝血功能障礙和器官系統衰竭）。在臨床試驗中，抗 IL6導向療法在CRS管理中非常有效。綜上所述，這些數據表明IL6在CRS中具有重要的病理作用。

IL 6信號通路通過IL6與其特異性受體(IL6R)的相互作用發揮作用。后者以膜結合形式或可溶狀態(sIL6R)存在。IL6R與gp130受體復合，后者通過激活 JAK/STAT轉錄途徑作為復合物的信號轉導成分。值得注意的是，通過膜結合 IL6R的IL6信號傳導僅限于肝細胞、某些類型的上皮細胞和一些白細胞。這個過程被稱為順式信號。相反，在轉信號過程中，sIL6R被排泄到血清中，在那里它與循環IL6結合，并被普遍表達的gp130成分募集，可能影響許多組織。

為揭示CAR-T細胞激活過程中IL6的確切來源也做出了重大努力。使用共培養分析（CAR T細胞和APC）和參與CAR-T治療臨床試驗的患者的數據，單核細胞譜系APC被證明是唯一的IL6產生細胞類型?；诳缈坠才囵B測定的結果，重要的結論是，盡管響應于CAR-T介導的APC對白血病細胞IL6的識別而發生，但與CART19和APC之間的直接接觸無關。

最近的研究探索了CRS中的內皮激活，發現它可能顯著調節CRS的嚴重程度。在開始CAR-T治療之前或在sCRS發展和持續期間，發生sCRS的患者的內皮激活標志物（VWF和Ang2）升高。一個死于sCRS的患者的案例研究表明，內皮細胞是IL640的主要來源之一，因此暗示激活的內皮與整體IL6產生之間存在直接聯系。值得注意的是，迄今為止沒有證據表明T細胞或CAR-T細胞可能是IL632的重要來源。

重要的是，IL6僅影響幼稚的CD4+和CD8+ T細胞。激活后，T細胞經歷 IL6R密度的顯著損失，部分原因是其脫落增加并因此形成sIL6R44。因此，雖然IL6對CAR T細胞細胞毒功能的潛在影響問題確實存在，但可能性很小32。這是因為CD4+和CD8+ CAR-T細胞作為不再依賴IL6的活化T淋巴細胞發揮作用。

事實上，IL6被證明對CAR-T細胞轉錄譜或細胞毒性沒有影響。此外，已證明CART19在免疫缺陷ALL小鼠模型中的治療未能模擬臨床觀察到的CRS，但能夠在缺乏APC的小鼠中誘導持久緩解，從而強調免疫細胞（包括APC）相互作用在發病機制中的重要性。CRS。用抗IL6R抗體Tocilizumab 阻斷IL6并沒有顯著影響臨床治療效果，連同上述數據，表明IL6對CAR-T細胞功能是可有可無的。然而，應該提到的是，在Singh等人的研究中，沒有評估培養基中sIL6R的水平，因此不應完全排除CAR-T中不存在sIL6R依賴性轉信號。

目前，尚不清楚CD4+ CAR-T細胞與其正常的CD4+對應物相似，是否能夠產生sIL6R從而加重CRS的進程。然而，應該注意的是，根據Yang等人的工作，CAR信號激活的CD4+ CAR細胞的行為與TCR信號激活的CD4+ T細胞有很大不同。基于這一觀點，可以假設CD4+ CAR-T細胞中的sIL6R分泌也不同于常規CD4+ T 細胞中的分泌。顯然，這個重要的問題需要進一步的實驗研究。

如圖 3 所示，此類事件是在CRS的上下文中描述的。

最近，Teachey等人測量了51名接受CART19 (CTL019)治療的ALL患者（其中39名為兒科）的細胞因子和生物標志物水平。其中，沒有一項標準的臨床實驗室測試可以預測 CRS 的嚴重程度。此外，許多測試，如鐵蛋白、CRP、LDH、AST、ALT 和 BUN，僅在 CRS 發作后才顯示異常水平。細胞因子分析允許開發基于測量兒童（如 IFNγ、IL13 和 MIP1α）和成人（IFNγ、sgp130、eotaxin）的 2-3 種細胞因子的穩健預測模型。類似地，還開發了另一種預測系統（來自對 133 名患者的研究，JCAR014）28 基于在治療性輸注后的前 36 小時內持續發燒 >38.9度。在這里，sCRS 預測的敏感性為 100%（特異性為 84%）。對發燒 >38.9度 的患者的單一細胞因子 (MCP-1) 的信息進行分析，可以觀察到大約95%的特異性。與Teachey等人提出的模型相比，這種方法更可靠、可行且更易于遵循，因為僅需要測量133名患者中的30名患者的MCP-1值，以通過發燒測量安全地對其余患者進行分類.雖然非常令人鼓舞，但這些方法需要通過臨床試驗進一步探索。為了確保更大的穩健性，人們可能會建議不同的CAR-T設計最終可能還需要特定于設計的CRS預測量表。

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sCRS患者可能會出現巨噬細胞激活綜合征(MAS)，也稱為噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(HLH)。由于基于高血清細胞因子（如IFNγ）導致巨噬細胞激活的兩種病癥的發病機制具有共性，因此CRS相關MAS的鑒定很復雜。在CAR-T 療法之外，發熱、血細胞減少、高鐵蛋白血癥以及骨髓噬血細胞增多癥是關鍵的診斷特征。為了支持診斷，糖基化鐵蛋白對HLH/MAS的特殊診斷價值也已在多項研究中得到證實。在CART19治療后，在所有4-5級CRS患者和51%和83%的 CRS 0-3級患者中總是觀察到鐵蛋白>10000 mg/dL（兒童HLH的典型診斷參數，但在成人患者中沒有）分別在兒科和成人隊列中。因此，對于接受CAR-T治療的患者，HLH/MAS唯一可靠的指標是噬血細胞增多癥、低纖維蛋白原血癥和可能的高甘油三酯血癥，因為在CAR-T介導的CRS期間觀察到了上述所有其他診斷特征。有趣的是，在沒有其他HLH特征的情況下，噬血細胞作用被認為對成人的 HLH 診斷是非特異性的。

最近，據報道，接受CAR-T治療的患者中HLH/MAS的發生率低至約1%。這種情況的診斷標準是基于無法解釋的肝、腎和肺器官毒性和噬血細胞作用的嚴重程度。HLH/MAS的治療需要更積極的免疫抑制，包括基于依托泊苷/環孢素的方案。在這種情況下，糖基化鐵蛋白的診斷價值尚未得到研究，可能具有一定的潛力。

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據報道，神經毒性，也稱為 CAR-T 相關腦病綜合征 (CRES)，在 CART19 試驗中非常常見6,9,10,24,25。根本原因未知，可能與 CART19 細胞識別隱蔽的 CNS 抗原和脫靶細胞毒性無關。關于腦組織中 CD19 表達水平的數據存在矛盾，有更多證據表明 CNS56,57,58 中不存在這種抗原。值得注意的是，另一種 CD19 靶向藥物 Blinatumomab 的臨床試驗報告了神經毒性。除了 ALL 患者中的 CNS 腫瘤 59 和 CD22 外，在靶向其他腫瘤抗原時尚未明確觀察到 CRES。在后一種情況下，僅觀察到可能與發燒或合并癥有關的輕微主觀損傷。重要的是，必須指出的是，該試驗中沒有觀察到 sCRS 病例60，因為僅報告了 CRS 1 級和 2 級，但 sCRS 被稱為神經毒性的高危因素（≥3 級）61。

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CRES的臨床癥狀（圖4總結）通常包括頭痛、癲癇、譫妄、焦慮、震顫和書寫能力受損、失語、意識下降甚至昏迷腦水腫。CRES發生的中位時間為輸注后 4 天，中位持續時間為5天。CRES 的分級通常根據CTCAE v. 4.03進行，但該系統并不完善，因為它不是專門針對 CAR-T 神經毒性定制的。最近，MD安德森癌癥中心CARTOX小組基于10點神經學評估工具 (CARTOX-10)31 開發了一種新的分級系統（表 3）。非常方便，可以對患者進行快速、高頻次的評估。簡而言之，它評估患者在空間、時間和個性上定位自己的能力，以及評估他們的口語和寫作能力。

先前已經描述了將細胞因子運輸到CNS的幾種機制。這些包括它們通過血腦屏障(BBB)被動滲漏，通過主動攝取機制，通過激活內皮細胞和血管周圍巨噬細胞以及在CNS中免疫細胞積累下游的現場細胞因子產生。

在CART19治療之后，這些機制中的一些參與了。首先，CART19細胞穿透中樞神經系統，因為它們已通過PCR或流式細胞術在CSF中檢測到。這與觀察結果一致，即CART19治療成功消除了沒有后續CNS復發的患者的CNS疾病 。Gust等人發現腦脊液中幾種細胞因子（包括IL6和IFNγ）的濃度與血清水平相當。這被解釋為BBB功能失敗和/或由于在CNS中形成局部細胞因子來源。與這個想法一致，原代人BBB周細胞被證明在暴露于IFNγ和TNFα后會分泌IL6和 VEGF。

此外，CNS毒性與更高的 Ang2:Ang1 比率介導的 BBB 通透性增加有關，其中 Ang1 穩定 BBB 的內皮細胞，而 Ang2 具有相反的作用61。有趣的是，用芬戈莫德（一種 1-磷酸鞘氨醇受體調節劑）伴隨著更高的 Ang1 血清水平和降低的 BBB 通透性，從而改善了結果。對給予重組 Ang173 的小鼠進行了類似的觀察。因此，可以進一步探索Ang2:Ang1 比率的藥理學調節，以實現可接受的CAR-T相關CRES管理。為支持這些發現，人體尸檢結果顯示，兩名在 JCAR015治療后因腦水腫而死于 CRES 的患者的 BBB 崩潰74，突出了這種機制對嚴重CRES影響的重要性。

Neelapu等人報道，CRES的表現是雙相的，第一階段的出現與CRS癥狀同時發生，通常在CAR-T治療后的前5天內。這種“急性”類型的CRES傾向于更短、更溫和（1-2級），并且可能受益于抗IL6治療。作者提出，這可能是由于BBB通透性更高，這使得治療性抗體能夠到達 CNS?？笽L6治療有效性的另一種解釋是在CRES的“第一階段”期間沒有 BBB 損傷，因為內皮和周細胞沒有活性，局部不產生細胞因子。在這種情況下，在迅速治療和解決 CRS 后消除 IL6 將通過打破細胞因子“循環”來防止神經毒性的進展。隨后，CRES 的“第二階段”，甚至可能在細胞治療后3-4周發生（如在10%的患者中所見），可能是由于CNS內局部細胞因子源的形成。

雖然CRS和CRES的發病機制可能具有某些共同點，例如(1)APC（和周細胞或內皮細胞）產生IL6和(2)內皮失調（由于Ang2:Ang1比率和VWF增加），但CRS和CRES是不同的病理過程。

一般來說，在沒有任何CRS的情況下很少觀察到CRES，正如ZUMA-1試驗中的 CRES 研究所證明的那樣，其中90名患者中有5名患有CRES，但沒有CRS27，并且在Gust等人61患者隊列中（其中53名患者中有5名患有CRES，但沒有 CRS）。這些病例通常是輕微和主觀的（1級）。然而，也有一個病例報告稱，在沒有sCRS的情況下，一名患有嚴重CRES且CSF細胞因子升高的患者。考慮到CRS和CRES等級≥2的同時流行，CRS似乎會觸發CRES的發展，而CRES可能會繼續獨立發展（如圖 3 突出顯示）。

Gust等人建議預防CRES發展是可取的，因為一旦確定，它在 IL6定向治療后就不太可能消退。他們提出了一個≥4 級CRES的預測模型，該模型基于在 CAR-T治療后的前36小時內發燒≥38.9度以及血清IL6和MCP1水平升高。在這里，該模型的靈敏度和特異性分別為100和 94%61。或者，另一組分析53名成人的3-4級CRES提出了一個基于基線血小板計數33.2%）和骨髓中ALL形態學存在的模型，該模型預測了分級3-4 CRES具有 95%的敏感性和70%的特異性。

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一般來說，成功管理這些顯著不良事件包括解決三個關鍵點。

首先，在CAR-T輸注前仔細評估患者是必要的，因為存在一些與患者相關的風險因素，例如CRS的血小板減少癥和CRES的預先存在的神經系統疾?。ㄒ约皟烧叩母吣[瘤負荷.?

其次，強烈建議密切關注發熱作為CRS的第一個跡象，同時強烈建議對門診患者和住院患者使用CARTOX-10工具頻繁監測CRES臨床癥狀。

第三，使用抗IL6或類固醇進行支持治療。與Neelapu等人一致，當伴有任何級別的CRS時，在CRES早期開始抗IL6治療是合理的，以防止毒性進展。FDA批準的CAR-T的處方信息列于表1中，唯一提到的用于治療CAR-T誘導的CRS的IL6導向療法是托珠單抗（抗IL6R）。應該注意的是其他藥物，如作為抗IL6 (sil tuximab)、抗TNFα mAb（英夫利昔單抗）、可溶性TNFα受體（依那西普）和基于IL-1R的抑制劑（阿那白滯素）。然而，目前采用 Tocilizumab（有或沒有類固醇治療）的算法允許在FDA批準的產品中逆轉大多數CRS病例，因為ELIANA試驗中沒有報告與CRS相關的死亡，而ZUMA-1試驗。Tocilizumab 的給藥顯示 CRS 臨床癥狀（包括發熱和低血壓）迅速減弱。然而，這種藥物不能穿透中樞神經系統，反而可能會增加IL6的腦脊液水平，從而促進CRES的發展。因此，抗IL6藥物 Siltuximab 可能是首選（用于神經毒性管理），因為它不會增加血清IL6水平。因此，目前治療CRS和CRES的策略包括抗IL6療法，它通常在CRS處理中更有效，以及類固醇，通常用于治療CRES。

毒性控制的現代選擇還可能包括使用引入CAR-T細胞以快速消除（如果需要）的自殺基因，并且這種設計的CAR T細胞已經在臨床環境中進行了測試。此外，許多新的靶向治療方法也可能很快在提高療效和毒性管理方面具有巨大潛力。例如，有一項CAR-T的臨床前研究，該研究對分泌抗PD1抗體的多種抗原具有特異性，以提高療效。由于IL-6是一種與高毒性相關的細胞因子（顯然不會干擾CAR-T細胞功能和治療效果），因此開發分泌功能受損的IL6受體或抗IL6 抗體的CAR T細胞可能是關鍵安全有效的治療，同時無需抗IL6預防。

總之，CRS或CRES的管理具有挑戰性，因為這兩種并發癥都與血液中CAR T細胞的高峰值水平有關。另一方面，有效治療需要高濃度的CAR-T，因此降低CAR-T細胞水平會影響治療效果。

表 4 總結了CAR T細胞療法的其他副作用。

分析導致CAR-T 性的主要因素是復雜的，因為之前的試驗在幾個特征方面有所不同，例如CAR結構、疾病類型和淋巴耗竭類型。因此，我們必須注意這些差異，特別是在比較不同試驗的結果時。影響毒性的因素總結在表5中。

CAR-T研究的一個重要領域需要進一步發展，它源于CAR-T療法的臨床可用性有限。這里的考慮因素包括治療成本高以及與制造CAR-T所需時間段相關的給藥延遲。由于5-10%的患者出現生產失敗和上述其他原因，設計通用 CAR-T（稱為 UCART）的想法是一個快速發展的領域。例如，在2012年，Torikai等人。報道了一種通過修飾T細胞來設計 UCART 的合理方法，后者不僅表達第二代CAR，而且缺乏內源性T細胞受體的表達。在這里，UCART 能夠殺死 CD19+ 細胞并在體外增殖。Qasim 等人在2017年報道了另一種生成UCART的成功方法。這些UCART由Celectis（法國）提供，旨在沉默TCRA和CD52基因的表達，允許在治療期間使用 Alemtuzumab（一種抗CD52抗體）。用于防止宿主免疫依賴性殺死UCART的淋巴去除方案。在兩名患有復發性ALL的嬰兒中觀察到了這種方法的有效性。他們接受了這些UCART治療，沒有任何嚴重的CRS和神經毒性跡象。令人鼓舞的是，兩個孩子都達到了CR，并且微小殘留病呈陰性，并且在UCART給藥后18和12個月后仍保持CR。

擴展CAR-T的抗原靶點是另一種可行的方法。在這方面，Cellectis (2017) 發起的通用抗CD123 CAR-T (UCART123)療法不如CD19療法那么成功。在 AML 和母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤 (BPDCN) 的兩項臨床試驗中接受治療的前兩名患者經歷了sCRS和毛細血管滲漏綜合征(CLS)，導致其中一名患者死亡。Stemline Therapeutics的一項臨床試驗用單克隆抗體靶向相同的CD123，證明了與32名患者中有3名經歷了5級CLS（導致他們死亡）相似的毒性特征。然而，該療法被譽為普遍有效。同時，在AML和BPDCN患者中使用自體 CAR-T細胞靶向CD123的I期試驗沒有發現任何CLS病例，因此UCART123毒性特征可能歸因于細胞或其他未知因素。

另外，Celyad正在開發一種帶有Natural Killer Receptor-2的CAR-T，它可以潛在地針對實體和血液惡性腫瘤中的幾種抗原。在設計用于治療AML和MM的I期臨床試驗(NCT02203825)中，觀察到可接受的安全性特征，在前兩個（四分之四）劑量水平期間沒有CRS、TLS或腫瘤外/靶標毒性的證據。同時，盡管治療后總生存期有所改善，但沒有報告客觀反應。目前，一項招募了不同癌癥患者的I期臨床試驗正在進行中(NCT03018405)，并顯示出令人鼓舞的初步療效，使3名結腸癌患者中有2名疾病穩定，而1名 AML患者經歷了形態學CR。

此外，CAR-T細胞的其他“通用”靶標包括VEGF-1（和VEGFR2），它們不僅在血管內皮細胞上表達，還在不同譜系的腫瘤細胞上表達。雖然CAR-T VEGF-1的臨床前陽性包括抑制轉移，但使用CAR-T抗VEGFR2 (NCT01218867) 的試驗未能顯示出顯著的臨床活性。

展望未來，確實需要做更多的工作來充分發揮基于 CAR-T 的抗癌療法的潛力，但迄今為止這種療法的臨床結果令人非常樂觀，因此進一步的研究肯定是合理的，并且其結果令人熱切期待。