堿基編輯技術 (base editing)是基于CRISPR/Cas系統發展起來的新型靶基因編輯技術，目前依據堿基編輯酶的不同可分為胞嘧啶堿基編輯器 (cytosine base editor, CBE) 和腺嘌呤堿基編輯器 (adenine base editor, ABE)。堿基編輯技術因其高效、不依賴DNA雙鏈斷裂產生、無需供體DNA參與等優勢，已經成功應用在各種動物、植物及其他生物中，為基因治療及精準作物育種等領域提供了重要技術支撐。
然而，研究發現早期版本的CBE會在胞嘧啶脫氨酶的作用下在全基因組范圍產生一種低頻率Cas9-非依賴型的DNA或RNA的脫靶突變，嚴重影響單堿基編輯在基礎生物和臨床研究中的應用。基于此，珠海舒桐科技提供了一種快速、便捷、經濟的CBE脫靶效應的檢測技術—高通量R-loop脫靶檢測，是單堿基編輯中不可或缺的脫靶檢測方法，也是廣大科研人員進行CBE編輯器篩選的利器。相比于傳統的全基因組測序，R-loop高通量脫靶檢測省時省力，經濟實惠，可用于規模化的評估和篩選。
1 R-loop脫靶檢測實驗原理
利用CBE作用于單鏈DNA的特性，通過nSaCas9在編輯靶點外的基因組區段誘導R-loop，從而人為制造單鏈DNA（ssDNA）區域，可放大CBE系統在特定位點的Cas9非依賴型脫靶頻率。若CBE的脫氨活性在這些區域產生脫靶編輯，可通過高通量測序進行富集檢測，從而評估CBE編輯器的Cas9非依賴型脫靶效應。
參考文獻【1】
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R-loop脫靶檢測實驗流程
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R-loop脫靶檢測數據分析流程
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應用場景
（1）對于科研來講，目前CBE發展迅猛，存在不同來源的胞嘧啶脫氨酶，如rAPOBEC1、AID、CDA1等，同時多項研究對這些脫靶酶進行定向進化，以降低其脫靶效應。可通過R-loop的方法檢測改造后變體的脫靶效應，以篩選最優變體；
（2）對于臨床轉化來講，脫靶效應是基因治療中必須關注的問題。通過R-loop的方法檢測CBE的脫靶活性是評估臨床轉化安全性的重要手段。
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服務優勢
（1）直接在活細胞體內進行檢測，切割效率和脫靶效應更加符合實際；
（2）靈敏度高：能檢測Cas9非依賴型低頻脫靶突變，包括DNA突變和RNA突變；
（3）準確性高：檢測結果可通過實驗驗證；
（4）更短的服務周期：從質粒構建、準備細胞到最終可視化結果呈現，僅需一月。
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標準服務內容
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服務項目 |
周期 |
標準服務內容 |
報價 |
交付內容 |
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CBE編輯器脫靶效應評估 | ?
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質粒構建+細胞轉染+擴增子測序+分析 | ?歡迎垂詢 |
原始數據+可視化結題報告 |
*高級服務內容：根據項目/課題的需求可定制個性化分析，具體可與舒桐平臺聯系。
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送樣要求
（1）可提供目標基因序列，由我公司免費設計sgRNA；
（2）若客戶提供sgRNA序列，可由我公司構建sgRNA質粒；或客戶直接提供sgRNA質粒，由我司進行轉染及后續建庫測序，實驗用細胞系由客戶提供；
（3）若提供轉染后的細胞DNA，則需要：
1）DNA樣品總量：5μg以上，濃度50ng/μl以上；
2）DNA樣品純度：OD260/280=1.8~2.0；
3）DNA樣品完整性：DNA無明顯降解，需提供凝膠電泳檢測膠圖。
（4）如需我司進行一體化服務，可向我司咨詢詳情。
參考文獻：
【1】Doman JL, Raguram A, Newby GA, Liu DR. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nat Biotechnol 38, 620-628 (2020).
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