靶向ADCC：發(fā)掘NK細胞癌癥治療的潛能

抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC）是一種有效的細胞毒性機制，主要通過自然殺傷（NK）細胞介導(dǎo)。當(dāng)特異性抗體結(jié)合到靶向細胞膜上以后，免疫細胞通過該反應(yīng)誘導(dǎo)細胞死亡。這是抗體限制和控制感染的幾種主要機制之一。

抗體和免疫細胞的相互作用通過一個受體家族發(fā)生：Fc受體（FcR）。在人類中，IgG的FcR家族（FcγR）由6個受體組成：FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32a、FcγRIIb/CD32b、FcγRIIc/CD32c、FcγRIIIa/CD16a和FcγRIIIb/CD16b，其中CD16a主要負責(zé)觸發(fā)NK細胞介導(dǎo)的ADCC。因此，對CD16a作用機制的了解，有助于我們通過改善單克隆抗體最大限度地發(fā)揮NK細胞的潛力，從而擴大癌癥免疫治療的范圍。

NK細胞是一種天然的淋巴細胞，能夠非常有效地破壞應(yīng)激細胞，如病毒感染或腫瘤轉(zhuǎn)化細胞。通常情況下，ADCC效應(yīng)主要通過結(jié)合FCR的抗體激活NK細胞，NK細胞膜上最具特征的FcR就是FcγRIII（CD16），其中NK細胞主要表達CD16a，而CD16b僅限于中性粒細胞。人類NK細胞分為兩個主要亞群：CD56^bright和CD56^dim。CD56^brightNK細胞是強有力的細胞因子產(chǎn)生者，但缺乏CD16a；而CD56^dim具有高度的細胞毒性，表達CD16a。

當(dāng)通過CD16a識別IgG調(diào)理的靶點時，NK細胞就會釋放不同的細胞毒性分子，從而引發(fā)靶細胞的死亡。這種機制依賴于免疫突觸的形成和含有穿孔素和顆粒酶的溶解顆粒的脫顆粒。除了脫顆粒外，NK細胞還可以通過將靶死亡受體（如DR4、DR5或Fas）與其死亡受體配體（如FasL和TRAIL）結(jié)合來清除靶細胞。

CD16a是一種跨膜受體，具有短的C-ter胞質(zhì)尾，并具有兩個細胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域。它的細胞內(nèi)部分不具有任何信號成分，因此，為了傳遞信號，它需要兩條帶有免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAM）的信號鏈。

CD16a與IgG的CH2以1:1的方式相互作用，其中CH2上的N297位的 N-聚糖鏈在這種相互作用中也起著關(guān)鍵作用。因此，不僅氨基酸序列，其聚糖組成都可以極大地影響CD16a對Fc的親和力，從而影響ADCC的效力。

CD16a在其細胞質(zhì)尾部不具有任何ITAM結(jié)構(gòu)域，因此需要兩條含有ITAM結(jié)構(gòu)域的細胞內(nèi)鏈串聯(lián)的幫助，CD3ζ和Fc?RIγ。CD16a結(jié)合后，屬于Src家族的激酶Lck被激活，并磷酸化CD3ζ和/或Fc?RIγ的ITAM結(jié)構(gòu)域。磷酸化的ITAM允許來自Syk家族的激酶招募和磷酸化，例如Syk和ZAP-70，它們反過來負責(zé)后續(xù)的信號傳導(dǎo)。在它們的底物中，PI3K是高度相關(guān)的，因為它將PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，PIP3經(jīng)PLC-γ處理后釋放IP3和DAG。DAG激活PKC家族，這有助于觸發(fā)脫顆粒。IP3誘導(dǎo)鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，這種鈣內(nèi)流是ADCC觸發(fā)的主要信號之一，也導(dǎo)致核內(nèi)NFAT易位，誘導(dǎo)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。CD16a參與激活的其他途徑也有助于ADCC，例如ERK2 MAPK途徑。

CD16a依賴性NK細胞殺傷后，CD16a迅速下調(diào)。CD16a脫落的機制之一是由去整合素和金屬蛋白酶17（ADAM17）介導(dǎo)的，后者在NK細胞上表達。ADAM17對CD16a的切割發(fā)生在順式結(jié)構(gòu)中，這意味著表達ADAM17的NK細胞不能在另一個NK細胞上誘導(dǎo)CD16a脫落。激活后CD16a下調(diào)的另一個機制是內(nèi)化，這不僅發(fā)生在CD16a上，也發(fā)生在其他細胞內(nèi)信號成分上，如CD3ζ、ZAP-70和Syk。

細胞因子

提高ADCC活性的一個簡單方法是用促炎細胞因子刺激NK細胞。NK細胞移植已在多個臨床試驗中成功進行，例如通過輸注細胞因子誘導(dǎo)記憶樣（CIML）NK細胞，最常用的細胞因子組合包括IL-12、IL-15和IL-18。CIML NK細胞比傳統(tǒng)NK細胞表達更多的IFN-γ，對白血病細胞和原發(fā)性急性髓系白血病（AML）母細胞顯示出優(yōu)越的細胞毒性。

IL-12會增加NK細胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，在一項I/II期臨床試驗中，西妥昔單抗與IL-12聯(lián)合應(yīng)用于無法切除或復(fù)發(fā)的頭頸部鱗狀細胞癌患者。與無進展生存期（PFS）小于100天的患者相比， PFS大于100天的患者NK細胞在體外具有更高的ADCC活性。

IL-15是NK和CD8+T細胞生存和功能所必需的細胞因子。N-803是一種突變的N72D IL-15超激動劑，在臨床前模型和臨床試驗中顯示出增強的NK細胞體外和體內(nèi)活性。此外，它還增加了NK和CD8+T細胞的數(shù)量。

抑制ADAM17

ADAM17是激活后CD16a下調(diào)的主要驅(qū)動因素。改善NK細胞ADCC的一種策略是通過靶向ADAM17來防止CD16a脫落。研究發(fā)現(xiàn)，對NK細胞中使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ADAM17，顯示出更好的IFN-γ生成和體內(nèi)外ADCC活性。然而，也有研究顯示，阻斷ADAM17降低了NK細胞的存活率以及CD16a介導(dǎo)的連環(huán)殺傷，細胞無法與靶細胞分離，阻礙其運動到另一個靶細胞。

總之，ADAM17抑制的益處尚不清楚，結(jié)果也有爭議。這一策略是否能夠成功，有待于一項正在進行的臨床試驗（NCT04023071）結(jié)果，該試驗將評估攜帶不可切割CD16a的iPSC衍生NK細胞在AML和B細胞淋巴瘤中的應(yīng)用。

工程化抗體

抗體的Fc部分進行工程化改造，可以增加Fc對CD16a的親和力，并隨后改善ADCC。一些突變非常流行，例如，所謂的GASDALIE，由Fc中的4個替換組成：G236A/S239D/A330L/I332E。該突變顯示對CD16a的親和力顯著增加，而CD32b親和力幾乎沒有增加。

另一個突變稱為突變體18（F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L），ADCC顯著增加。這些突變現(xiàn)已作為抗HER2抗體margetuximab進入臨床，并在I期治療各種HER2陽性癌時顯示出良好的效果。

此外，抗體Fc N-聚糖的糖工程化有望增加對CD16a的親和力。研究最多的糖修飾是去糖基化，例如去巖藻糖修飾。這種修飾導(dǎo)致與CD16a的結(jié)合增加，ADCC改善。這項技術(shù)已被用于抗CD20抗體obinutuzumab。

NK細胞接合器

除了工程化抗體之外，還可以研究抗體的形式。基于雙特異性T細胞接合器（BiTE）策略的成功，為NK細胞開發(fā)了一種類似的形式，即所謂的雙特異性殺傷細胞接合器（BiKE）。BiKE由兩個scFv通過連接序列組成，一個單鏈抗體靶向CD16a，另一個靶向腫瘤抗原。

此外，還有三特異性殺傷細胞接合器（TRiKE），有2種腫瘤抗原與CD16a一起被靶向，或者添加IL-15代替第三種單鏈抗體。這種結(jié)構(gòu)的使用允許NK細胞重新定位到腫瘤細胞，并導(dǎo)致針對靶細胞的強大ADCC作用。

AFM13是一種針對CD16a和CD30的雙特異性抗體，目前處于臨床Ⅱ期，用于治療外周T細胞淋巴瘤、轉(zhuǎn)化型蕈樣變性和霍奇金淋巴瘤。在一項治療復(fù)發(fā)或難治性霍奇金淋巴瘤的Ib臨床研究中，AFM13與pembrolizumab的聯(lián)合治療產(chǎn)生了88%的客觀反應(yīng)率，總反應(yīng)率為83%。GTB-3550是一種CD16/CD33/IL-15的TRiKE形式，目前正在進行多種類型白血病的I/II期試驗研究（NCT03214666）。

調(diào)節(jié)代謝途徑

代謝失調(diào)是腫瘤微環(huán)境中免疫抑制的關(guān)鍵驅(qū)動因素，許多研究已經(jīng)表明，免疫細胞代謝對其功能至關(guān)重要。最近，一些代謝藥物在增強NK細胞活性方面顯示出有希望的結(jié)果。二甲雙胍，被證明可以增加免疫細胞配體的表達，尤其是ICAM-1的表達。ICAM-1是一種整合素，可以調(diào)節(jié)淋巴細胞細胞內(nèi)信號，包括NK細胞。二甲雙胍與UCB聯(lián)合使用擴增NK細胞在體外和體內(nèi)顯示出更高的腫瘤細胞清除率。

此外，另一種策略是直接調(diào)節(jié)NK細胞代謝。cMyc是調(diào)節(jié)小鼠NK細胞糖酵解和氧磷代謝機制的關(guān)鍵因子，缺乏cMyc會導(dǎo)致NK細胞反應(yīng)受損。糖原合成酶激酶-3（GSK3）可介導(dǎo)小鼠NK細胞中cMyc的降解。與此一致，在AML患者的NK細胞中檢測到GSK3過度表達，并與針對AML細胞的細胞毒性受損有關(guān)，GSK3抑制劑可恢復(fù)這些NK細胞的活性。目前，一些臨床試驗正在評估GSK3抑制劑LY2090314對實體癌和血液癌的療效（NCT01632306、NCT01287520和NCT01214603）。

靶向CD16a可能有助于解決當(dāng)前癌癥免疫治療治療抗體的一些現(xiàn)有局限性，從而最大限度地提高ADCC促進更有利臨床結(jié)果的潛力。然而，依然有一些未解決的問題亟待回答：

• 靶向CD16a優(yōu)于其他NK細胞激活受體的優(yōu)勢是什么？

• 激活NK細胞觸發(fā)ADCC的最有效方法是什么？激活NK細胞能在多大程度上觸發(fā)適應(yīng)性免疫以增強總體抗腫瘤活性？

• NK細胞接合器能促進NK細胞在腫瘤部位的歸巢和持續(xù)存在嗎？

• 腫瘤內(nèi)CD16a+NK細胞和巨噬細胞的表達水平如何？由于CD16a在NK細胞和巨噬細胞上都有表達，因此我們有必要了解當(dāng)特異性靶向CD16a時，不同免疫細胞類型相對于不同腫瘤實體的貢獻。

• CD16a脫落對ADCC活性及其臨床療效的影響是什么？用不可脫落的CD16改造細胞產(chǎn)品有好處還是壞處？

• 一線治療后NK細胞受體或靶向腫瘤抗原的下調(diào)是否會影響NK細胞接合器療法的療效？

• NK細胞激活劑的臨床療效如何受到患者年齡、治療開始時的健康狀況和預(yù)處理方案等參數(shù)的影響？

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應(yīng)細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產(chǎn)生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。通過CD16a的ADCC作用是NK細胞發(fā)揮效應(yīng)器功能的主要機制之一。因此，對CD16a的生物學(xué)的深入了解有助于我們找到增強ADCC作用的策略，從而提高NK細胞的抗腫瘤活性。

參考文獻：

1.From CD16a Biology to
Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Improvement. Front Immunol.2022;
13: 913215.

2.?Reimagining
antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural
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