CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤中的作用

免疫療法是癌癥治療中的一種新興趨勢，旨在增強宿主免疫系統以識別和破壞癌細胞。它包括單克隆抗體，免疫檢查點抑制劑，癌癥疫苗，過繼性細胞療法和細胞因子。過繼免疫療法是一種涉及修飾T細胞的免疫療法，T細胞充當“活體藥物”，在患者體內繁殖，識別具有特定抗原的癌細胞并殺死它們。嵌合抗原受體（CAR）-T細胞不是化學療法中使用的藥物；相反，它是一種由患者的血細胞制成的活生物體。這種癌癥療法可導致持續緩解，副作用更少，患者生活質量更高，使其成為其他常規癌癥療法（如化學療法，放射療法和手術切除術）的首選治療方案。

T細胞在細胞介導的免疫反應中起著至關重要的作用。在過去的幾年中，已經開發出許多療法來重定向，培養和增強針對腫瘤的T細胞?；赥細胞的過繼免疫療法圍繞著開發新方法來應對惡性腫瘤，尤其是血液系統癌癥。這種新興療法包括三種模型：腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），T細胞受體（TCR）修飾的T細胞和CAR-T細胞。與CAR-T細胞療法相比，前兩種技術本身并未對T細胞進行明顯的修飾，因此療效并不顯著。而且，生產過程，成功率低以及對疫苗的依賴限制了它們的發展。作為一種嶄新的治療方案，CAR-T細胞在過去的三十年中經受了時間的考驗，其許多產品現已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的批準。

CAR-T細胞療法的優點是完成所需的治療時間短。在長期緩解方面，它比其他傳統癌癥治療得分更高，患者的生活質量更高。與干細胞移植也需要積極的化學療法相比，大多數患者可以通過CAR-T細胞療法快速恢復。與依賴于靶細胞的主要組織相容性復合體（MHC）表達進行抗原識別的TIL和TCR不同，CAR-T細胞可識別特異性抗原，而不受靶細胞對抗原的加工和MHC限制，從而依次殺傷腫瘤細胞有效。

CAR-T細胞療法的過程 CAR-T細胞療法的基本過程涉及血液分離，然后是白細胞分離，我們從患者體內抽血，并分離淋巴細胞（白細胞）。然后將其轉發給基因工程實驗室，然后通過無活性病毒/非病毒載體將基因插入T細胞，以在其表面產生嵌合抗原受體（CARs）。這些經過重新設計的CAR-T細胞在實驗室中繁殖了大約2至3周，然后冷凍并送去重新輸注。同時，我們進行條件化學療法以降低患者的白細胞，并為融化的CAR-T細胞輸液奠定了基礎。然后，CAR-T細胞通過顆粒酶/穿孔素介導的凋亡幫助殺死腫瘤細胞。

CAR-T細胞由細胞外，跨膜和細胞內結構域以及柔性鉸鏈組成，這也增加了靶標識別效率。細胞外結構域具有識別腫瘤相關抗原的抗原結合結構域，即單鏈可變片段（scFv）。細胞內結構域由TCR復合物CD3ζ鏈的基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM）組成，該激活基序激活了共刺激信號。

CAR技術正在得到廣泛的研究，并發展到了連續幾代人。第一代CAR包含單鏈可變片段（scFv），接頭，跨膜結構域和細胞內CD3ζITAM 。第二代CAR具有額外的細胞內共刺激結構域，例如CD28或4-1BB受體（CD137）。第三代CAR具有兩個額外的共刺激域，例如CD28或CD41BB和CD134。第四代CAR-T細胞還由各種共刺激成分組成，例如細胞因子，抗體或其他功能性蛋白質。他們可以識別并去除一些早期T細胞無法識別的抗原。下面列出了不同世代修飾和精制的CAR-T細胞的摘要（圖1）。

迄今為止，CAR-T細胞療法已在多種血液系統惡性腫瘤中進行了試驗和測試，包括復發/難治性（r/r）套細胞淋巴瘤，B細胞非霍奇金淋巴瘤-B-NHL（原發性縱隔B細胞淋巴瘤，彌漫性大細胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤），多發性骨髓瘤（MM），慢性淋巴細胞性淋巴細胞性白血病（CLL），成人和兒童復發/難治性急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）。B-ALL患者中CD19特異性的CAR-T細胞可以達到70-94％的平均完全緩解率。

專業人士一直在研究CAR-T細胞療法，其中包括許多排列組合以及失敗/復發，難治性治療以及迄今為止取得的一些積極進展。此外，其中有幾項獲得了FDA的批準，包括諾華公司的Kymriah，該產品主要用于ALL患兒和青壯年，也用于彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中。Gilead的Yescarta，用于DLBCL；和Kite的Tecartus被接受為r/r套細胞淋巴瘤的首個CAR-T治療藥物。

圍繞血液惡性腫瘤的臨床試驗表明，CAR-T細胞療法已幫助多年無效的多種癌癥治療患者緩解。此外，它還可以防止他們的癌癥惡化，幫助他們更長壽，并且在少數情況下，他們還可以從干細胞移植等治療中受益。但是，局限性在于復發，這可能是由于抗原逃逸和CAR-T細胞的持久存留所介導的。

嵌合抗原受體-T細胞療法已成為新興的癌癥免疫療法，已顯示出顯著的效果，尤其是在血液系統惡性腫瘤中。這些療法的廣泛探索工作已成功治療兒童和成人的惡性腫瘤（表1），如復發性B細胞急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞性白血病，包括非霍奇金淋巴瘤在內的淋巴瘤。r/r濾泡性淋巴瘤（FL）;并彌漫性大B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

CAR-T細胞療法的臨床試驗主要集中在CD19，CD20，CD22，CD30，CD38，BCMA，GPC3和其他著名的抗原靶標上。在美國，靶向CD19的臨床試驗占CAR-T細胞試驗的40％以上。截至2017年8月，全球約有200項涉及CAR-T細胞的臨床試驗，其中約65％涉及血液系統惡性腫瘤，其中80％涉及靶向B細胞癌的CD19 CAR-T細胞。

目前，臨床研究中的CAR-T細胞項目涉及48個以上靶標。截至2020年6月，已在中國進行了357項臨床試驗，在美國進行了256項試驗，在其他國家進行了58項試驗。

盡管CAR療法具有無可否認的益處，但在使用CAR療法時，仍然需要對許多副作用進行嚴格的檢查。在大多數患者中，神經毒性和細胞因子釋放綜合征（CRS）是常見的副作用。其他還包括與CAR-T細胞相關的腦病綜合征，巨噬細胞活化綜合征，吞噬性淋巴細胞組織細胞增生，移植物抗宿主病，靶標/腫瘤外毒性，過敏反應和感染。由于過度的T細胞增殖和癌細胞的破壞，導致發生CRS，從而在體內引起免疫反應。

在大多數使用抗CD19 CAR-T細胞療法的患者中，神經毒性是一種副作用。神經毒性的證據包括內皮功能障礙，血管不穩定，毛細血管滲漏，血腦屏障破壞和彌散性血管內凝血（DIC）。由于相同的分子生物標記物可以在某些正常組織或器官中表達，尤其是在淋巴組織中，因此CAR-T細胞療法可以破壞正常組織，稱為靶上/腫瘤外毒性，例如抗CD19中的B細胞發育不全。

盡管該領域的研究不斷增長，但有限的T細胞持久性導致復發和不良反應成為該方法廣泛使用的瓶頸。

生產一批CAR-T細胞所需的時間也有所進步，因為最初要花幾周的時間，但是現在許多實驗室已將時間縮短到不到7天。我們在下圖中總結了CAR-T細胞向患者的生產和運輸過程（圖2）。

盡管已經取得了很大的進步，但是CAR-T細胞療法的使用仍然涉及許多挑戰。

不利的副作用

輸注CAR-T細胞后，由于細胞在體內繁殖以對抗癌癥，患者可能會遇到一些嚴重的副作用，例如CRS和神經毒作用。這些副作用的程度（表2）和CAR治療的療效取決于患者先前接受的治療，淋巴結清掃的量，化療方案以及輸注時的疾病程度。

影響CAR-T細胞活性潛能的因素

其他因素，例如免疫原性（在反復給藥的情況下，應使用人源化scFvs而非小鼠抗體以預防過敏反應或其他嚴重功能障礙），腫瘤微環境中的免疫抑制成分，在CAR-T輸注前進行免疫抑制預處理（導致貧血，凝血病，和中性粒細胞減少癥）可能會影響CAR-T細胞的活性和安全性。在完成治療后，癌癥復發率也是與CAR-T細胞療法的整體功效有關的重要問題。

在CAR-T細胞設計和遞送方面已經進行了令人印象深刻的研究和開發，以提高治療腫瘤細胞的效率，持久性，浸潤性和抗凋亡能力。

CAR-T細胞的基本結構具有由腫瘤靶向/抗原結合結構組成的細胞外結構域，即抗體衍生的單鏈可變片段（scFV）；鉸鏈區；跨膜結構域；細胞內信號結構域由帶有CD3 Zeta鏈的激活基序（T細胞受體復合物）組成，為T細胞激活提供信號，導致產生毒性細胞因子（例如IFNγ，TNFα）攻擊腫瘤細胞。與典型的T細胞受體不同，CARs是與靶細胞表面抗原結合的合成受體，與靶細胞的抗原加工無關并且與MHC限制無關，從而防止了腫瘤細胞的免疫逃逸。

但是，通過添加其他CAR部件進一步修飾CAR-T細胞以形成下一代CAR-T細胞，已導致其有效性和持久性得到改善。重建CAR部分也是一種新的方法，可用于抗原逃逸或多種腫瘤抗原在淋巴瘤，多發性骨髓瘤和其他類型惡性腫瘤中共存。

改善CAR-T細胞治療安全性和效率的最新進展，以應對其應用中的挑戰

1、下一代CAR-T細胞

研究人員已經在開發一些安全策略，以預防或減少CAR-T細胞療法的不利影響。這樣制造的T細胞被稱為下一代CAR-T細胞。

自殺基因轉換：包括在CAR T細胞中表達特定基因，該基因作為“安全自殺基因轉換”（通過施用無毒分子或相關單克隆抗體激活），只要有發展就會破壞CAR-T細胞嚴重毒性。

合成分裂受體：在Lim及其同事提出的合成分裂受體中，T細胞活性的時間，位置和劑量可以通過藥理學調控精確而遠程地控制。在該系統中，抗原結合和細胞內信號傳導成分在沒有小分子的情況下被分離，并且在用異二聚化小分子處理后開始組裝。因此，可以在體內用該小分子有效地控制CAR-T細胞，并且可以簡單地通過改變小分子的劑量來調節諸如靶細胞殺死的應答的幅度。

Juillerat等人的另一種合成分裂受體。可以通過添加小的二聚化分子藥物，將CAR結構直接在鉸鏈結構域激活。在以劑量依賴的方式使用分子誘導劑后，工程化的CAR-T細胞表現出顯著的細胞裂解活性。這些新型可控CAR-T細胞的開發，通過提高臨床中CAR-T細胞療法的安全性，開創了新穎且有吸引力的方法來控制潛在的不良反應。

組合靶抗原識別：涉及用兩種不同的CAR改造T細胞，只有在識別出同時在腫瘤細胞上表達的一組不同抗原后，才能完全激活T細胞。例如，CAR+嵌合共刺激受體，雙特異性串聯CAR的組合。僅表達這些抗原之一的正常細胞不能激活這些T細胞，從而顯著降低靶點上/腫瘤外的毒性。

合成Notch受體：合成Notch（synNotch）受體的最新發展有助于避免天然T細胞，從而克服了免疫療法中的毒性。SynNotch由細胞外抗原識別域（通常是單鏈可變片段，scFv），Notch核心調控區和細胞內域（ICD）組成。SynNotch受體使用胞外域識別靶抗原。然而，如在CARs中所見，靶抗原的結合不會觸發T細胞活化。一種抗原的synNotch受體驅動靶向第二種抗原的CAR的后續表達。僅當兩種抗原均存在時，T細胞才能被激活。具有這些受體的T細胞可改善其有效性和安全性。

雙特異性T細胞銜接子（由兩個單鏈抗體組成的BITE抗體）：雙特異性T細胞銜接子是通過一個接頭（連接子）連接兩個scFv而構建的，該接頭可以同時與兩個特異性抗體（scFv）結合。scFv中的一個通過CD3受體與T細胞結合，另一個通過腫瘤特異性抗原與腫瘤細胞結合。在沒有小雙特異性分子的情況下，這些CAR-T細胞對正常組織沒有活性。這些細胞提高了T細胞的效力和腫瘤選擇性，從而增強了它們的功效和安全性。一種針對CD19的單克隆抗體Blinatumomab已于2014年獲批用于復發和難治性B細胞ALL。與酪氨酸激酶抑制劑一起使用時，它們在改善長期預后方面是安全有效的。

抑制性嵌合抗原受體：將抑制性受體應用于CAR-T細胞是一種安全策略。抑制性嵌合抗原受體（iCAR）由對正常組織表達的抗原具有特異性的scFv和強大的抑制性信號傳導域（來自PD-1和CTLA-4）組成，以限制腫瘤外T細胞的活性。iCAR以暫時和可逆的方式顯示出抗原特異性抑制T細胞活性，細胞因子分泌和增殖。

研究人員已嘗試將CAR-T細胞療法與化學療法和放射療法相結合，以克服對CAR-T細胞療法使用的限制，減少疾病的不良反應，增強腫瘤抗原的識別能力，并提高CAR-T細胞療法的療效和持久性T細胞。CAR-T細胞和檢查點抑制劑療法（靶標PD-1和PD-L1，CTLA-4和B7相互作用）的組合也可以解決抗原逃逸的問題。

改善CAR-T細胞能力，抵抗TME并降低免疫原性的其他新研究領域包括：

（1）多目標CAR-T細胞技術；

（2）T細胞制造方面的改革（例如，降低與使用病毒載體相關的風險，包括DNA損傷，并降低生產成本和生產時間：通過以非病毒為基礎的技術替代它們，例如Sleeping Beauty和PiggyBac換位導致產生具有高持久性和低DNA損傷的T細胞，從而解決了各種潛在的與插入相關的突變）；

（3）基因編輯技術，包括使用非整合型慢病毒載體，通過配備趨化因子基因的溶瘤病毒募集CAR-T細胞，利用CRISPR/cas9技術生成CAR-T細胞（聚簇的規則間隔的短回文重復序列/ CRISPR-相關蛋白九）和使用CAR-NK（自然殺手）細胞。

除了上述技術方面，要使CAR治療更容易獲得，還有一個領域需要解決，那就是所涉及的巨額費用。目前，在美國，Tiga-Cel（Kymriah）的價格為$ 475,000，而Axi-Cel（Yescarta）的價格為$ 350,000，這對于世界上大多數人來說可能負擔不起，這限制了這種療法的使用[39]。我們列出了各種可能的解決方案，以克服CAR-T治療的局限性，以幫助理解和更快地過渡到臨床領域中的應用（圖4）。

ELIANA和ZUMA試驗的成功，導致FDA批準了幾種CAR-T細胞療法，導致了與第四代和下一代CAR-T細胞相關的漸進研究，包括最新技術，這些技術已經處于不同的階段。世界各地的臨床試驗。只有大規模取得實質性積極成果，才能建立長期利益。

因此，我們最終推斷，需要進行創新的實驗研究以增強CAR-T細胞療法進展的有效性，這將為醫生和患者提供消除惡性腫瘤的信息和療法。這篇評論文章的局限性在于，在人類的不同研究之間缺乏統計分析，無法比較個體在各種血液系統癌癥中的有效性。作者僅考慮了過去六年的研究。

在全球范圍內，研究人員一直在尋找新穎的抗癌策略。CAR-T細胞免疫療法就是其中之一，目前正在密切注視下，以帶來一場癌癥治療方面的革命。在過去的十年中，CAR-T細胞的抗腫瘤功能激發了許多人開展各種臨床試驗并研究CAR療法的發展，功能和結果。

FDA對某些CAR療法的批準及其商業可行性預示著CAR Technologies進入了一個新時代。但是，局限性包括不利的副作用，有限的T細胞持久性，腫瘤逃逸，腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制成分，癌癥復發率以及所涉及的巨大制造成本，這些都限制了許多人為獲得全部潛力而付出的努力。汽車療法。在探索和確立這些發明的有效性的同時，它為未來的研究留出了很大的范圍和機會，以開發可有效解決當前局限性并導致治療方法廣泛應用的CAR技術創新。未來研究人員感興趣的領域可能是CAR-T細胞設計的優化，過繼性細胞療法/聯合療法的聯合使用，微環境修飾和免疫阻滯策略。探索性研究通過多靶點方法或與其他治療方法組合來降低CR（完全緩解）后的復發率是另一個關鍵領域?？赡苓€需要更多的臨床研究，以將其應用擴展到其他領域的癌癥，如髓樣白血病和實體癌。

在這篇綜述中，我們概述了CAR-T細胞療法的發展現狀，其在血液系統惡性腫瘤中的應用，局限性，應對挑戰的最新研究進展以及將其應用推廣和擴展到現有和各種用途的未來研究范圍其他癌癥治療。通過這次審查，我們打算為該領域的學生，研究人員和同事提供參考，以更好地了解CAR-T細胞療法的當前和未來趨勢。

Cureus| The Role of Chimeric Antigen Receptor-T Cell Therapy in the Treatment ofHematological Malignancies: Advantages, Trials, and Tribulations, and the RoadAhead

Published:?February25, 2021?

DOI: 10.7759/cureus.13552