AML的CAR-T擴增方案

3.1、AML患者的T細胞擴增

1.使用溫T細胞培養基解凍AML患者的冷凍PBMC，以500 g離心7分鐘以去除DMSO，然后重懸于T細胞培養基中。平板以1×10⁶細胞/mL的濃度放置，并在37℃，5％CO2的培養箱中靜置過夜。

2.取一等份進行流式細胞術，用CD45，CD3染色和活/死染色。使用流式細胞儀采集以確定T細胞的百分比和總數。

3.準備CD3/CD28 Dynabeads：計算出達到PBMC與總PBMC比例為3:1所需的珠子數量。輕輕地上下吹打一分鐘，使珠子重懸。不要渦旋。在1.5 mL試管中的1 mL TCM中加入所需體積的珠子，然后輕輕重懸以進行洗滌。將試管放入磁體中（例如DynaMag-2，Thermo Fisher Scientific）并等待1分鐘。取出介質時不要干擾小珠。重復洗滌步驟三遍。洗滌后，將珠重懸于500-1000μL的T細胞培養基中。

4.如果使用燒瓶，則將珠子以1×10⁶細胞/mL的濃度加到已經接種的細胞中。如果計劃使用板的多個單獨的孔，則將珠子添加到錐形管中的細胞中，然后分配1 mL等分的細胞/珠子混合物。保持在37℃，5％CO₂的培養箱中。刺激的一天（將珠子添加到細胞中）代表第0天。

5.從第3天開始，隔天使用Coultermulti-sizer對細胞進行計數。用TCM培養細胞，使終濃度達到1×10⁶細胞/mL。

6.在第6天，按以下步驟除去珠子：通過上下移液幾次輕輕重懸細胞，收集細胞，然后將其置于15 mL或50 mL錐形管中。將試管放入磁鐵（例如DynaMag-15，Thermo Fisher Scientific）中，然后等待2分鐘以使珠子移至側面。用移液管吸出管中部的細胞懸液。以1×106/mL細胞的溫熱的TCM在新的燒瓶中重懸，使用Coulter多功能分選器和平板計數。

7.記錄計數和平均細胞體積（MCV）并繪制圖形以生成增殖曲線（圖1）。隨著T細胞被激活，MCV增加，然后在激活后第5天到第7天達到最大值，然后隨著T細胞開始休息而下降。

8.當MCV達到300 fL時，細胞已充分休息（通常在9-14天之內），可以用于以后的實驗或冷凍。以10％DMSO的速率控制方式在90％的胎牛血清中以10×10⁶/mL的速度冷凍細胞。融化后的回收率應高于75％。

9.圖1代表5名AML患者的T細胞擴增動力學。

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3.2、AML患者在T細胞擴增前富集T細胞

1.我們發現殘留的AML母細胞的存在會損害T細胞的擴增。通過流式細胞術分選將T細胞與AML分離，純度達到100％。然后將T細胞與AML細胞以不同比例混合（圖2a），進行刺激和擴增。AML細胞枯竭后，T細胞擴增有顯著改善。

2.為了富集原代AML樣品中的T細胞，可以進行CD3/CD28Dynabeads或CD4/CD8陽性選擇。

3.使用CD3/CD28磁珠富集T細胞：解凍，以1×106細胞/mL平板接種AML樣品，靜置過夜（如小標題3.1所述）。計數，準備和清洗珠子（如小標題3.1中所述）。將珠子添加到細胞中，將細胞放入15 mL或50 mL錐形管中，并在室溫下旋轉45分鐘進行孵育。在此期間，T細胞將與珠子緊密結合。將試管放入磁鐵中，等待1分鐘。珠子（以及連接到它們的T細胞）將遷移到側面。從試管中心輕輕吸出培養基（此時該培養基主要含有AML細胞，而不是與CD3/CD28 Dynabeads結合的T細胞）。在TCM中重懸磁珠（和附著的T細胞），用Coulter多功能分選器計數，并以1×106細胞/mL的速度平板接種。取一等份用于流式細胞術（如小標題3.1中所述）。如小標題3.1所述，繼續進行T細胞擴增。圖2b代表CD3 / CD28富集后T細胞擴增曲線的一個例子。

4.使用CD4/CD8陽性選擇富集T細胞：融化，以1×106細胞/mL平板接種AML樣品，并在培養箱中于37℃過夜（如小標題3.1所述）。用與PE偶聯的CD4和CD8抗體染色，然后根據制造商的說明使用MACS富集抗PE微珠。選擇T細胞后，如小標題3.1中所述刺激和擴增T細胞。

3.3、從AML患者中產生慢病毒CART

1.如前所述[19]產生CAR慢病毒質粒。

2. CAR慢病毒是通過用特定質粒轉染293 T細胞而產生的，如上所述[19]，將上清液冷凍在-80℃下。

3.如小標題3.1和3.2中所述開始T細胞擴增。

4.在第1天，用慢病毒轉導T細胞。在室溫下逐漸解凍冷凍的慢病毒上清液20-30分鐘。將先前滴定的慢病毒上清液以3.0的感染復數滴加到T細胞中。通過輕輕旋轉平板來重懸。

5.在第6天，通過流式細胞儀檢查CAR表達。取等分的T細胞，用流動緩沖液清洗一次，用抗CAR抗體染色和活/死染色，清洗兩次，然后用小鼠抗人CD45和CD3染色。在流式細胞儀上獲取以確定轉導效率。我們通常獲得50-75％的轉導效率。

6.繼續執行小標題3.1中概述的其余擴展。

7.圖3代表從AML患者產生的CD123指導的CAR T細胞的實例。引入CAR轉基因為T細胞提供了擴展優勢（圖3a）。

3.4、從AML患者中產生RNA修飾的CAR T細胞

1.如小標題3.1所述，接種AML樣品并開始T細胞擴增。

2.如前所述，將CAR慢病毒構建體亞克隆到pDA載體中[18]。

3.使用mMESSAGE mMachineT7ULTRA轉錄試劑盒通過體外轉錄產生RNA。如前所述，使用RNeasy Mini Kit純化RNA。

4.當MCV低于300 fL時，可以用RNA電穿孔T細胞或將其在胎牛血清中與10％DMSO冷凍，以備將來使用。

5. T細胞的電穿孔：如果使用冷凍的擴增T細胞，則在溫熱的TCM中融化，以500 g離心7分鐘以去除DMSO，并在37℃，5％CO2的培養箱中靜置過夜。從現在開始，在冰上執行所有程序。

6.將細胞轉移至50 mL錐形管中，并用冷OptiMEM洗滌3次。兩次洗滌之間以500g的轉速旋轉7分鐘。第三次清洗后，完全吸出上清液，并重懸于冷OptiMEM中，最高300×10⁶細胞/mL。將T細胞轉移至子彈管（100μL）（30×10⁶ T細胞）至每個子彈管。加入RNA（每1×10⁶ T細胞1μg），并通過上下移液幾次輕輕重懸。將細胞和RNA從每個子彈管轉移到比色皿中，并置于冰上。

7.開啟ECM830電子方波發生器，將機器設置為500 V和700μs。將比色杯放入機器中，牢固擰緊到位并脈動。用1 mL溫熱TCM清洗比色皿3次，并將細胞轉移至六孔板中。加入T細胞培養基使濃度達到2×106細胞/mL。在37℃，5％CO2的培養箱中培養。

8.電穿孔后將細胞靜置2-4小時。然后可以使用細胞或將其冷凍以用于將來的實驗。

T cell Media (TCM): X-vivo 15 media (Fisher Scientific),human serum 5% (GeminiBio-product, Inc., West Sacramento,CA, USA), penicillin, streptomycin (10,000U/mL, ThermoFisher Scientific), and glutaMAX (100×, Thermo Fisher Scientific).