CAR-NK細胞療法當前的局限性

低持久性

在缺乏細胞因子支持的情況下，輸注細胞在體內缺乏耐久性是過繼NK細胞治療的主要缺點之一。雖然它可能是安全的，但它可能會限制 NK細胞免疫療法的療效。

外源性細胞因子已被證明可以增加過繼輸注NK細胞的增殖和持久性；然而，它們也會引起不良副作用，包括抑制性免疫亞群的生長，例如Tregs。

多項研究報告了通過使用轉基因編碼細胞因子的轉基因NK細胞，這些細胞因子在膜上表達或組成型釋放，從而取得了有希望的結果。

在一項這樣的研究中，攜帶NK-92細胞或原代NK細胞的腫瘤攜帶小鼠用產生IL-2或IL-15的逆轉錄病毒載體轉導，其增殖和持久性增加。已經證明，將IL-15轉基因整合到CAR構建體中可以改善高危淋巴惡性腫瘤患者的NK細胞增殖、體內持久性和抗腫瘤活性，而不會增加IL-15的全身水平或引起毒性。

其他帶有細胞因子轉基因的裝甲CAR-NK細胞正在開發(fā)中；然而，目前還沒有公布的報告。增加NK細胞持久性的另一種方法是誘導類似記憶的表型，例如用細胞因子混合物（IL-12、IL-15和IL-18）在短時間內預激活它們，以誘導分化為細胞因子誘導的記憶類NK細胞。記憶樣 NK細胞最近被修飾以表達針對CD19的CAR，并在體外和體內對NK抗性B細胞淋巴瘤的反應得到改善。

運輸?shù)剿璧哪[瘤部位

快速歸巢到腫瘤床對于過繼細胞治療效果至關重要，并且受NK細胞釋放的趨化因子與腫瘤細胞之間復雜的相互作用控制。NK細胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議，因此促使人們努力改進它。趨化因子受體CCR7通過吞噬作用從K562飼養(yǎng)細胞轉移到NK細胞，這導致NK細胞更好地歸巢到淋巴結。

在CXCL10轉染的黑色素瘤的異種移植小鼠模型中，在NK細胞上過表達CXCR3在用輻照的EBV-LCL飼養(yǎng)細胞和IL-2離體生長后導致更好的運輸和抗腫瘤活性。

此后，幾位研究人員研究了各種工程方法來改善NK細胞歸巢。例如，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA對NK細胞進行電穿孔，以增加向表達趨化因子CCL19的淋巴結的運動。用編碼CXCR2的病毒載體轉導的 NK細胞對表達同源配體如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細胞癌腫瘤具有更好的運動性。

在另一項研究中使用具有可切割CXCL16分子的NK細胞募集蛋白偶聯(lián)抗體（NRP體）來增加NK細胞運輸和滲透到胰腺腫瘤中。Furin是一種在胰腺癌細胞表面表達的內切蛋白酶，可裂解CXCL16，從而通過ERK信號級聯(lián)促進NK細胞浸潤。

在胰腺癌的小鼠模型中，這種方法被證明可以改善 NK 細胞介導的腫瘤抑制。CAR-NK細胞也經過改造，以提高它們到達腫瘤部位的能力。Müller等人證明，經過修飾以產生CXCR4的抗EGFRvIII CAR-NK 細胞賦予了膠質母細胞瘤小鼠模型中分泌CXCL12/SDF1的膠質母細胞瘤細胞選擇性趨化性，從而導致更好的腫瘤消退和存活。此外，在已建立腹膜卵巢癌異種移植物的小鼠中，經過修飾以表達CXCR1的NKG2D CAR-NK細胞顯著增加了抗腫瘤反應。

為了提高實體瘤患者NK細胞免疫治療的成功率，已經在小鼠模型中研究了幾種促進NK細胞運輸?shù)侥[瘤部位的新技術；然而，這些方法的功效應該在臨床試驗中得到驗證。

免疫抑制腫瘤微環(huán)境

TME包括免疫抑制可溶性化學物質、免疫抑制細胞和最佳免疫細胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細胞治療成功的主要障礙。TGF-β;腺苷;吲哚胺 2,3-雙加氧酶(IDO)和前列腺素E2(PGE2)是TME中發(fā)現(xiàn)的免疫抑制細胞因子和代謝物，可損害NK細胞活性。一些不利的代謝因素，如缺氧、酸度和營養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中誘導免疫抑制。因此，研究人員正在努力開發(fā)可以防止其中一些免疫抑制作用的CAR-NK細胞。

改造NK細胞以使其對TGF-β具有抗性已被證明是一種很有前景的策略。使用CRISPR/Cas9技術刪除原代人類NK細胞中的TGF-β受體2（TGFβR2）基因，使它們對這種免疫抑制性生長因子免疫，而不會失去它們對AML的功效。

同樣，經過基因改造以表達顯性失活TGF-β受體（一種由TGFβR2 產生的高親和力非信號轉導受體）的NK細胞能夠抵消TGF-β對NK細胞的抑制作用并恢復其細胞毒性。一種針對miR-27a-5p的抗 miRNA，一種在NK細胞中被TGF-β升高的miRNA，在體外和體內都改善了NK細胞的效應器功能。

此外，腺苷是一種重要的免疫抑制代謝物，由外核苷酸酶CD73和 CD39在缺氧和壓力下由ATP產生，它通過阻斷NK細胞上的高親和力A2A 腺苷受體而成為靶向，從而導致更有效的抗腫瘤活性。乳腺癌、黑色素瘤和纖維肉瘤的小鼠模型。

TME導致NK細胞衰竭的另一個重要方法是檢查點分子相互作用。為了克服這個問題，基因組編輯被用來消除NK細胞中的檢查點成分，以改善它們的功能。在攜帶腫瘤的小鼠中，TIGIT缺失被證明可以防止NK細胞耗竭并增強預后。

一些研究人員研究了NKG2A，發(fā)現(xiàn)NKG2Anull NK細胞對表達HLA-E 的惡性腫瘤表現(xiàn)出更高的細胞毒性。最近的研究表明，將CAR工程與檢查點刪除相結合可有效增強NK細胞抗腫瘤活性（通過靶向CIS，細胞因子信號傳導的負調節(jié)因子）。經典的T細胞檢查點PD-1和CTLA4是另外兩種正在NK細胞中研究的抑制分子。

最近詳細討論了使用檢查點阻斷來改善NK細胞效應器活性。文獻綜述表明，創(chuàng)造性的工程技術和基因組編輯技術可能會克服NK細胞的生物學局限性和TME造成的障礙。如果開發(fā)出改善NK細胞持久性、向腫瘤部位轉移和效應器功能的策略，那么使用NK細胞的過繼療法可能會從僅具有中等療效的安全治療轉變?yōu)樽鳛榘┌Y免疫療法一線治療的有力競爭者。敵對和惡性環(huán)境。

慢病毒轉導效率低

基于慢病毒的轉導系統(tǒng)是細胞中基因修飾和傳遞的最常見方法之一。然而，由于天然特性，NK細胞對慢病毒具有抗性，這使得基于慢病毒的轉導成為一個挑戰(zhàn)。

為了改善病毒轉導，已經使用了各種化學品。例如，可以使用硫酸魚精蛋白或聚合物（葡聚糖或聚凝胺）去除細胞膜上的電荷。同樣，在HSC和祖細胞中，環(huán)孢菌素A和雷帕霉素可能有助于消除不同的慢病毒限制障礙。有趣的是，據(jù)報道抑制細胞內抗病毒防御機制可以提高人類NK細胞中慢病毒轉導的效率。此外，還發(fā)現(xiàn)vectofusin-1、前列腺素E2和葡聚糖分別促進人類HSC、T淋巴細胞和原代NK細胞的轉導率。

此外，已發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可通過上調LDLR水平來提高VSV-G慢病毒轉導NK細胞的有效性。此外，Colamartino ABL等人揭示了一種使用狒狒包膜假型慢病毒載體(BaEV-LVs)進行NK細胞轉導的有效且有彈性的方法。他們觀察到新鮮分離的人類NK細胞和來自NK細胞活化和擴增系統(tǒng)(NKAES)的細胞的轉導率分別為23.0±6.6%和83.4±10.1%（平均值±SD）。此外，用BaEV-LV轉導的CAR-CD22在38.3±23.8%（平均值 ±SD的NKAES細胞上表現(xiàn)出強大的CAR表達，尤其是破壞了NK抗性pre-B-ALL-RS4細胞系。使用編碼雙重CD19/CD22-CAR和低病毒滴度的較大載體成功轉導和重新擴增表達雙重CAR的NKAES，以有效殺死CD19KO-和CD22KO-RS4 11細胞。

此外，Bari R等人發(fā)現(xiàn)用修飾的狒狒包膜糖蛋白假型化的慢病毒載體的轉導率是VSV-G假型化慢病毒載體的20倍或更高 。此外，使用CD19-CAR，他們實現(xiàn)了對表達CD19的細胞系的高效和特異性殺傷。

盡管CAR-NK細胞與CAR-T細胞一起是可選的、具有潛在競爭性的癌癥免疫治療候選物，但仍有許多障礙有待克服，包括異質性、低持久性、向腫瘤部位轉移、敵對的TME和腫瘤抗原的丟失。

設計CARs最關鍵的一步是識別高度一致表達的靶腫瘤抗原。大多數(shù)腫瘤相關抗原(TAA)也由幾種健康細胞表達；因此，實現(xiàn)“在靶點、腫瘤外”的效果是不可避免的。此外，由于兩種逃避免疫監(jiān)視的主要策略——克隆進化和降低的TAA表達，可能會在來自同一腫瘤的單細胞克隆中觀察到這些TAA的表達存在巨大差異。為了克服這個問題，雙特異性CAR被設計為在前列腺癌中同時靶向兩種不同的抗原，并獲得了非常令人鼓舞的結果。

同樣，為了克服實體瘤中CAR的可及性或運輸困難，使用了幾種方法，包括局部給藥、腹腔給藥和聚焦超聲引導遞送。例如，發(fā)現(xiàn)胸膜注射在模擬人類胸膜惡性腫瘤的原位模型中非常有效，其功能持續(xù)時間甚至比靜脈注射獲得的更長?；贑AR的免疫細胞的區(qū)域給藥也可能有助于降低治療劑量。此外，已經使用聚焦超聲將抗HER2 CAR-NK-92細胞注射到轉移性乳腺癌小鼠的大腦中。為了最大限度地減少CAR-NK細胞造成的嚴重組織損傷，超聲脈沖和微泡的靜脈注射通過完整的顱骨，允許NK-92細胞暫時通過血腦屏障。

腫瘤具有多種免疫抑制因子，例如TGF-β、IL-10、PD-1 或精氨酸酶。有幾種方法可以降低TGF-β的抑制作用。例如，已發(fā)現(xiàn)TGF-β激酶抑制劑和NK細胞的組合保留了NKG2D和CD16的細胞毒性和表達。同樣，由于在實體瘤中的安全性和耐受性，使用fresolimumab（TGF-β中和抗體）或galunisertib（TGF-βRI 抑制劑）已顯示出非常令人鼓舞的結果。此外，已經發(fā)現(xiàn)使用配備有細胞外TGF-β受體結構域的混合CAR在提高NK-92細胞的抗腫瘤潛力方面非常成功。此外，通過敲低實體瘤中的SMAD3（TGF-β的下游介質），NK細胞的細胞毒活性已成功增強。同樣，已發(fā)現(xiàn)顯性失活TGF-β受體的表達在保留UCB-NK細胞產生IFN-γ和殺死膠質母細胞瘤細胞的能力方面非常有效。

TME的進一步特征是營養(yǎng)缺乏和嚴重缺氧導致酸中毒，最終抑制免疫反應。缺氧通過干擾代謝和增強幾種腫瘤生長因子和血管生成的表達來幫助腫瘤發(fā)展。此外，缺氧通過降低多種NK細胞激活受體（包括 NKG2D、NKp30、NKp44 和 NKp46）的表達來促進腫瘤生長和轉移。此外，已發(fā)現(xiàn)CD73在缺氧狀態(tài)下會誘導精氨酸酶（一種免疫抑制代謝物）來阻斷NK細胞的活性。研究人員已經通過增強NKG2D-CAR-NK細胞對肺癌腫瘤部位的歸巢證明了抗腫瘤活性的提高。

幾個免疫檢查點調節(jié)和抑制NK細胞活性。這些免疫檢查點充當“天然制動器”，以防止過度激活引起的自身免疫性疾病或免疫病理狀況。癌細胞可以通過表達幾種抑制或阻斷免疫細胞活化的檢查點蛋白來逃避免疫監(jiān)視。這些檢查點的基因缺失或阻斷可以幫助CAR-NK細胞保持過度活躍并更快地擺脫癌癥和轉移。例如，已發(fā)現(xiàn)TIGIT通過對抗CD226來防止NK細胞的細胞毒性。此外，在PD-1+ NK細胞中觀察到增殖和效應潛能降低，而在PD-L1+ NK細胞中觀察到效應活性提高。隨后，通過檢查點阻斷劑抑制PD-1或PD-L1成功地實現(xiàn)了耗竭免疫細胞的重新激活和持久的臨床結果。此外，已經觀察到CAR和檢查點蛋白（PD-1、CTLA-4、LAG3和TIGIT）阻滯劑的組合具有持續(xù)的治療益處。

已發(fā)現(xiàn)表達CD16、IL-2和PD-L1特異性CAR的NK-92細胞通過分泌大量穿孔素和顆粒酶來破壞多種人類癌細胞，例如乳腺癌、肺癌和胃癌細胞。有趣的是，抗體作為檢查點抑制劑的使用正在幾項臨床試驗中開發(fā)。例如，最近開發(fā)了兩種mAb，即lirilumab（IPH2101或1-7F9）和IPH4102，分別專門針對KIR和KIR3DL2。Lirilumab已被設計為靶向KIR2D共有的常見表位，該表位通過破壞抑制性KIR-L/HLA 相互作用，使NK細胞具有同種異體反應性以殺死癌細胞。在I期試驗中，已發(fā)現(xiàn)該抗體與來那度胺聯(lián)合用于NK刺激對MM非常安全、可耐受且臨床有效。此外，IPH4102已用于治療皮膚T細胞淋巴瘤，因為這些惡性腫瘤具有更高的KIR3Dl2表達。在I期試驗中發(fā)現(xiàn)這種治療具有良好的耐受性和臨床有效性，結果非常令人鼓舞，將推動進一步的大規(guī)模臨床研究。

另一個尚未引起足夠重視的增強CAR-NK細胞活性的重要策略是調節(jié)腫瘤代謝。在缺氧條件下，腺苷是通過D39和CD73代謝ATP產生的，CD39和CD73參與免疫逃避、阻斷NK細胞向腫瘤部位的轉運和阻止NK細胞成熟。此外，已發(fā)現(xiàn)使用抗CD39和抗CD73抗體抑制腺苷在增強靶向治療卵巢癌的效果方面非常成功。CD73可能是治療多種實體腫瘤（如膠質母細胞瘤、前列腺癌和肺癌）的重要靶點，因為它在這些腫瘤中高度表達。NKG2D工程化的CAR-NK細胞在基于抗CD73抗體的抑制作用后顯示出治療肺癌的有希望的效果。

為了克服CAR治療后的抗原丟失，可以同時靶向多種抗原。這可以通過多種方式實現(xiàn)；例如，可以同時注射針對不同抗原的不同CAR；另一種方法可能涉及使用兩種CAR的載體，這些載體可以在細胞生產步驟中組合和使用，以獲得配備單個CAR和兩種CAR的細胞混合物。然而，制造多個載體所涉及的高成本和導致臨床分析不佳的CAR異質性仍然是該策略的主要缺點。另一個重要的方法是設計一種可以識別多種抗原的CAR。這個目標可以通過“串聯(lián) CAR”來實現(xiàn)，其中兩個結合劑連接到一個分子上以提高免疫突觸的效率。此外，內部核糖體進入位點的核糖體跳過序列可以幫助使用單個載體在同一免疫細胞上生成多個 CAR，稱為“雙順反子 CAR”。比拉莫維奇等人。最近使用編碼三個獨立 CAR 的三價載體靶向膠質母細胞瘤上的三種不同抗原。非常有希望的是，最近，使用CAR同時靶向多種抗原的試驗數(shù)量有所增加。我們預計未來會有更多試驗研究能夠同時靶向兩種或多種抗原的CAR。

圖1?有下一代CARs能夠更好地應對免疫逃逸并提高基于CAR的免疫療法的細胞毒性潛力：Multi CARs配備了兩個或多個獨立的CARs，表達各種ScFvs以靶向癌細胞。串聯(lián)CAR在單個 CAR分子中配備了兩種不同的scFv。在健康細胞中識別抗原后，抑制性 CAR 往往會抑制免疫細胞的激活。在switch CAR中，某些能夠與iCasp9發(fā)生二聚化的化學物質被有條件地施用以激活下游的半胱天冬酶分子，從而導致表達CAR的細胞凋亡。Supra CAR配備兩種分體式結構；抗原結合域 (zipFV) 和功能域 (zipCAR) 在結合后激活表達CAR的細胞。

?

另一個重要的策略是增加CAR-NK細胞的活化。NK細胞激活的主要目標是CD16，它可以在接合時誘導殺傷效應。為CAR-NK細胞鑒定更多此類蛋白質/受體可能會提高CAR-NK療法的功效。其他提高基于CAR 的NK細胞療法安全性的重要方法可能包括通過整合自殺基因或開發(fā)雙特異性CAR分子以更好地靶向腫瘤特異性抗原來修改 CAR構建體。有趣的是，CAR-NK細胞同樣可以以 CAR 依賴和 CAR 非依賴的方式靶向腫瘤；因此，可以想象，NK 細胞的這種特性應該被用來發(fā)揮增強的腫瘤殺傷作用并開發(fā)非信號傳導 CAR。這些非信號 CAR 缺乏直接殺傷信號，但可以通過促進這些細胞對目標的駐留和粘附來增強 NK 細胞的合法殺傷技術 (218)。另一個有趣的策略是設計可以通過免疫抑制或免疫激活調節(jié)或重新編程局部 TME 的 CAR。已經開發(fā)出一種這樣的基于 CAR 的 NK 細胞，并命名為“裝甲”CAR-NK 細胞或“NK 細胞藥房”。這些非常特殊的 CAR-NK 細胞表達幾種外源基因，可以調節(jié)局部 TME 以防止任何有害影響。

與此一致，基于CAR的NK細胞療法和幾種替代療法的結合可能是有效根除腫瘤的非常有效的選擇。例如，在CAR-NK細胞輸注之前，可以使用幾種化學物質進行免疫抑制，以防止或延遲宿主防御系統(tǒng)對 NK 細胞的排斥。同樣，CAR-NK細胞療法與放射療法相結合可以變得更有效。先前已經證明放療，尤其是立體定向放療(SBRT)，有助于提高免疫治療的療效。輻射會導致 DNA 損傷，從而誘導癌細胞上的NKG2D表達，并為NK細胞活化并因此產生殺傷作用鋪平道路。因此，CAR-NK 細胞療法和放射療法的組合可能是替代針對贅生物的合理選擇。

已經使用自體NK細胞的過繼細胞轉移進行了大量臨床研究，以根除多種腫瘤類型，例如淋巴瘤、乳腺癌、結腸癌和肺癌。然而，由于在NK細胞上發(fā)現(xiàn)的抑制性受體和在癌細胞上發(fā)現(xiàn)的自身 MHC I類的相互作用，結果并不令人滿意，抗腫瘤活性較差。這種自我識別阻止了 NK 細胞的刺激。例如，成熟的NK細胞在惡性階段的壽命很短，因此沒有看到長期的不良反應。盡管如此，其他種類的NK細胞，例如，通過臍帶血或HSC產生的，具有更長的壽命并可能造成長期損害。為了克服這個問題，研究人員正在研究一種新的方法來整合對CAR-NK細胞感興趣的半胱天冬酶控制的自殺載體，這可能會迅速消除那些被轉導的細胞。在這方面，當代的一項研究表明，在CD19-CAR+IL15 NK細胞的可說服半胱天冬酶 9（iCAS-9）自殺方案中添加匹配的小分子二聚體可在4小時內引起細胞凋亡。由于來自KIR配體不相容性的供體-受體NK細胞同種異體反應性，AML患者中的HLA不匹配供體造血移植可能會在沒有GVHD的情況下預防復發(fā)和移植排斥。由于幾項臨床研究強調了KIR-HLA相互作用在HSCT中的重要性，KIR基因分型在不久的將來可以作為供體選擇的一個重要因素。KIR基因分型的成本極具競爭力且易于實施；因此，可以與HLA基因分型一起用于供體篩選。事實上，一些使用 KIR 基因分型進行供體選擇的試驗正在進行中。因此，這種方法也可以選擇未來以靶向CAR為基礎的免疫療法。

此外，KIR2DSs和KIR3DSs使用ITAM (DAP-12)磷酸化酪氨酸殘基和募集ZAP-70或Syk，以增強NK細胞活化和NK細胞對腫瘤細胞的識別。因此，可以利用KIR的這種潛力來改進和高效的基于CAR-NK的免疫療法。

過繼免疫療法通常伴隨著某些副作用。將過繼性免疫療法相關風險降至最低的一種方法是賦予免疫細胞靶向腫瘤特異性新抗原。隨著抗原篩選技術的進步，越來越多的腫瘤新抗原識別方法被采用，包括庫存共享的新抗原肽庫、全外顯子組測序結合質譜以及通過吞噬作用檢測新抗原。因此，未來的 CAR-NK 免疫療法可以通過采用這種方法來改進，以更好地治療對常規(guī)抗癌療法具有抗性的腫瘤。

總的來說，NK細胞免疫生物學領域的進步和進步為更好和新穎的免疫療法奠定了基礎。NK細胞優(yōu)異的抗腫瘤血系使它們成為基于細胞的免疫療法的焦點。特別是，可以利用不依賴于HLA表型的NK細胞識別來開發(fā)NK細胞庫，而不是修飾的CAR-NK細胞。隨后的CAR-NK細胞有望成為新型抗癌療法，可以作為“現(xiàn)成”產品?；虿僮?、抗原篩選技術和KIR分型領域的進步使得具有強大抗腫瘤潛力的新型、更強大、靶向靶向的CAR-NK細胞得以開發(fā)。同樣，雙特異性CAR和串聯(lián)CAR的使用、基因缺失/阻斷檢查點抑制和調節(jié)腫瘤微環(huán)境是少數(shù)可以更好地治療多種腫瘤類型的其他策略。隨著CAR-NK免疫療法在臨床前研究和臨床研究中的安全性增強和有希望的成功，再加上克服現(xiàn)有挑戰(zhàn)的令人印象深刻的努力，我們將在不久的將來見證癌癥治療的進步和改進。

doi:10.3389/fimmu.2021.707542