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簡單的背景介紹，請看前文《干細胞重建角膜恢復視力：Holoclar產品介紹》，本文介紹另一種（干）細胞重建角膜的療法，即人角膜內皮細胞（human corneal endothelial cell，HCEnC）治療。

眼球和角膜的解剖結構如下：

據不完全統計，我國因角膜病致盲人數約有400多萬，占全國致盲性眼病的第二位。但是大部分的角膜盲是可以通過角膜移植手術治療。角膜移植手術面臨的主要問題是供體材料來源嚴重匱乏，因我國國民受傳統觀念影響，捐獻的角膜數量遠遠不能滿足臨床的需要。因此，科學家們在不斷的探索研究，選擇其他的角膜來源，用于角膜損傷的治療。

目前，人角膜內皮細胞療法（HCEnC療法）僅在少數國家開發，包括日本、新加坡和美國。2021年日本一團隊報道追蹤角膜內皮細胞治療術后5年的臨床結果，11只眼中有10只眼的角膜內皮功能恢復正常，平均±標準偏差中心角膜ECD為1257±467個細胞/mm²（范圍601-2067個細胞/mm²），10只眼的最佳矯正視力（BCVA）顯著改善，未觀察到與角膜內皮細胞治療直接相關的重大不良反應^[1]。

日本的團隊于2018年發表在《新英格蘭醫學雜志》的臨床研究，發現HCEnC聯合前房注射rho相關蛋白激酶（ROCK）抑制劑治療大泡性角膜病，在細胞注射后24周，11只接受治療的眼睛的HCEnC細胞密度超過500個細胞/平方毫米（范圍947-2833），其中10只的HCEnC細胞密度超過1000個細胞/平方毫米，11只眼中有10只眼的角膜厚度小于630μm（范圍489-640），11只眼中有9只眼的最佳矯正視力提高了兩行或更多^[2]。

（1）HCEnC的原代分離

HCEnC的獲得，通常需要通過角膜組織的機械剝離和酶消化，從供體角膜中分離出來HCEnC（稱為單細胞培養法）。因此，在分離過程中，存在其他細胞類型，特別是基質成纖維細胞交叉污染的潛在風險。為了克服這個問題，可以考慮使用磁性細胞分離技術用于去除污染基質成纖維細胞^[3]，或選擇性熒光激活細胞分選以從基質成纖維細胞中純化和分離HCEnC^[4]，或者耗時更長的連續培養法^[5]。

已知供體年齡增加與增殖能力降低和細胞衰老相關，這可能影響HCEnC的總產量^{[6, 7]}和供體角膜的利用率^[8]。與年齡較大的供體(≥50歲）相比，HCEnC是從年輕供體（≤30歲）分離出來的HCEnCs具有較高的增殖能力^[9]。幾項研究表明，較年輕的供體HCEnC不容易發生細胞染色體異常（核型異常）^[10-13]。鑒于核型異常與腫瘤發生之間的聯系尚不清楚，因此建議盡可能從年輕供體獲得原代HCEnC細胞。影響HCEnC細胞質量的還有供體的死亡原因^[14-16]。

與對照組的細胞相比，使用粘彈性溶液（Viscoat）的HCEnC細胞的融合率、細胞密度、六角型細胞形態、Ki-67陽性率和線粒體強度顯著升高，而細胞面積和多態性顯著降低^[17]。加入熱可逆凝膠聚合物（TGP）的新型角膜保存雞尾酒來保持和運輸角膜組織，有利于角膜組織細胞的后續培養，增強角膜內皮細胞密度維持和角膜緣細胞的外植體培養^[18]。

從供體角膜剝離Descemet膜的較慢速度可能會增加HCEnC的損失量^[19]。在細胞分離之前，將供體Descemet膜內皮細胞（DM-EC）片放置在缺乏生長因子的穩定培養基中數天，可以增強HCEnC的增殖^[20]。

（2）HCEnC的擴增培養

到目前為止，主流兩種體外HCEnC細胞增殖擴增技術，即單培養基和雙培養基方法^[21]。幾個研究小組之前已經觀察到HCEnC的增殖能力受培養基（包括生長因子和補充劑）的影響^[22-24]。雙培養基培養系統，即利用交替的高有絲分裂培養基（M4）和低有絲分裂培養基（M5），在第2代之后培養HCEnC，并保持所需的六角形細胞形態，顯著擴大的HCEnC數量^[25]。使用單一培養基的替代方法也被證明能產生高產量的均質HCEnC，包括：（i）基礎培養基（含Opti-MEM1、FBS、生長因子和補充劑）、MSC條件培養基和Rock抑制劑 Y-27632的聯合使用^{[12, 24]}；和（ii）補充激素上皮培養基（SHEM），由補充FBS、生長因子和補充劑的DMEM/F-12組成^[26]。HCEnC還可以結合生物支架的3D打印技術來進行培養和移植治療^[27]。

HCEnC的轉錄組譜受培養環境所致的細胞有絲分裂速度的影響^{[23, 25]}。與高促有絲分裂環境相比，低有絲分裂環境表現出更好的HCEnC形態，表達更多HCEnC特異性基因，并顯示出更高的內皮細胞功能^[23]。也許，在特定的培養體系下，某些生長因子在刺激HCEnC提高增殖活性的同時，增加了內皮細胞向間充質細胞轉化（EMT）的發生。體外培養的HCEnC的增殖能力受細胞培養期間的接種密度的影響，接種密度>10000個細胞/cm²，能實現了更均勻的形態和更好的增殖潛能^[28]。

當然，HCEnC培養在各種生物材料的支架上面，甚至可以配合3D生物打印技術，形成移植治療前的角膜^[29]。

（3）HCEnC的細胞學鑒定

健康人群的研究證明正常角膜內皮細胞的細胞形態（六邊形）存在高度差異，表明六邊形的細胞形態不是預測內皮功能的可靠參數^{[30, 31]}。新加坡制定的HCEnC釋放標準包括兩種功能相關標記物（即Na+/K+ATP酶和ZO-1）的免疫組化檢測，兩種細胞表面標記物（即CD166和PRDX-6）的流式細胞術檢測，以及基因表達標記物的聚合酶鏈反應（即COL8A2和SLC4A11）。

（4）HCEnC的儲存和運輸

儲存或保存技術，包括溫度、使用的儲存介質和保存時間長度，已被證明會影響HCEnC的質量和內皮角膜移植術的成功^[32-35]。因此，儲存和運輸的優化將變得至關重要，以使世界各地的其他國家都能獲得這種新療法。盡管低溫是一種易于運輸的儲存方法，但研究表明，低溫條件下培養的HCEnC的體外生存能力較差，可能與氧化應激和冷誘導損傷有關^{[35, 36]}。HCEnC的儲存后生存能力受多種儲存因素的影響，包括培養基（Endo SFM優于Optisol-GS）、溫度（4°C和37°C優于23°C）以及保存時間（2天優于4-6天）^[37]。使用BiobankerhRM（一種低溫保存試劑）在-80°C下儲存HCEnC至少14天，同時在儲存后保持約90%的細胞存活率^[38]。這些技術可促進HCEnC的冷凍儲存和運輸，有利于實現HCEnC治療的大規模商業化。

（5）HCEnC的產品釋放標準

因此，有專家認為用于細胞治療的理想HCEnC批次應滿足以下產品釋放標準：（1）具有典型六邊形形態的足夠數量的細胞和生存能力（限制在前3代內）；（2） HCEnC相關生物標志物的表達；（3）明確定義和可量化的成分，包括內皮細胞、潛在雜質（如基質成纖維細胞等非理想細胞）和懸浮培養基（如維護、儲存和運輸培養基）；（4）采用符合GMP的工藝制造；（5）無微生物污染（如細菌、支原體、真菌和病毒）^[39]。

參考文獻：暫不提供

干細胞重建角膜恢復視力：Holoclar產品介紹

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