抗原呈遞細胞能促進臍帶血CAR-NK細胞的抗腫瘤活性

使用分別表達膜結合白介素 21 (mbIL-21)、4-1BBL 和 CD48 轉基因的逆轉錄病毒載體轉導親本 K562 細胞（圖 1A）。簡而言之，制備病毒上清液并用于依次轉導 K562 細胞。在每次穩定轉導后，進行有限稀釋克隆，并將特征最好的克隆用于下一輪操作（圖 1B）。通過連續轉導和重復克隆，每個單獨的轉基因獨立地整合到特定的基因組位點，確保不會干擾其他轉基因的表達。在引入mbIL-21和4-1BBL 后，我們生長出一個適當穩定的中間細胞系，稱為克隆46 或C46（圖 1B）。該克隆是通過有限稀釋選擇的，并在功能上測試轉基因表達的最佳水平，以及提供 NK 細胞增殖的最佳誘導。使用 CD48 構建體進行最后一輪轉導，該構建體還帶有熒光標記 (Katushka)，產生了一個三陽性細胞群，可用于進一步表征（圖 1B）。這些三陽性細胞通過流式細胞術進行免疫表型分析，然后進行另一輪細胞克隆，產生 181 個初級克隆，克隆33被選為最適合進一步表征的克隆，我們隨后將其稱為通用抗原呈遞細胞或uAPC（圖 1B） .

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使用流式細胞術門控策略對親本 K562、克隆 46 和 uAPC 細胞進行免疫表型分析，如圖 2A 所示。簡而言之，選擇“髓樣”門控細胞作為單細胞，并研究活細胞的 mbIL-21、4-1BBL（CD137L）和 CD48 表達（圖 2B-D）。uAPC 中的mbIL-21、4-1BBL 和 CD48 轉導效率>75%，并且在300天內保持穩定（圖 2E）。CD32 用于確認 K562 細胞的身份。因此，這些數據證實了穩定共表達 mbIL-21、4-1BBL 和 CD48 的基于 K562 的 uAPC 細胞系的產生。我們還證實，我們基于基因工程 K562 的 uAPC 的倍增時間范圍為 23.26 至 26.42 小時（n = 3 個獨立實驗），這與之前關于親本 K562 和衍生細胞系的報告一致。

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首先，我們測試了uAPC是否可以促進CB-NK細胞的體外擴增。在與uAPC共培養7 天和 14 天后，我們分別觀察到研究級NK細胞的9倍（中值= 8.96，范圍=8.26-10.1）和 903 倍擴增（中值=784，范圍=752-1,174）（圖 3A）。

重要的是，與 uAPC 共培養的非轉導 (NT) 對照和 iC9/CAR.19/IL-15（CAR 轉導）研究級NK細胞在第15天和第22天均表現出高 NK 細胞純度（>97%）。通過流式細胞術確定與 uAPC 共培養（圖 3B、C）。

此外，uAPC 擴增的iC9/CAR.19/IL-15 (CAR)-NK細胞保留了它們的CAR表達（>85%）（圖 3B、C），產生顯著更高水平的 IFN-γ 和 TNF-α，并顯示與 NT NK 細胞相比，對 CD19+ Raji 淋巴瘤細胞的更多脫顆粒（CD107a）和細胞毒性（圖 3D-F）。CAR NK 細胞在殺死 CD19 陰性 K562 靶標方面與 NT NK 細胞一樣有效（圖 3F），表明先天NK細胞殺傷機制在 uAPC 刺激后保持不變。我們還測試了 uAPC 支持 NK 細胞擴增超過14天的能力。NK 細胞用uAPC+IL-2 擴增 1 周。然后在每周存在或不存在每周uAPC飼養細胞的情況下收集細胞并與 IL-2 (100 U/ml) 一起長期培養。

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此外，我們比較了用 uAPC 擴增的CAR轉導的CB-NK細胞的端粒長度、體外和體內活性與先前報道的表達 4-1BBL和mbIL21的K562衍生的 APC (C9/IL-21) 。我們觀察到在體外使用兩種飼養細胞系產生的 NK 細胞的端粒長度、倍數擴增或細胞毒性沒有顯著差異。重要的是，uAPC 擴增的 CAR-NK 細胞在 Raji 異種移植小鼠模型中發揮了優異的體內抗腫瘤活性（圖 3G-I）。在直接比較中，使用由同一 CB 供體產生的 CAR-NK 細胞，接受用 uAPC 擴增的 CAR-NK 細胞的小鼠實現了更好的腫瘤控制（圖 3G、H）并且與用 CAR 治療的動物相比存活時間明顯更長（圖 3I） – 用 C9/IL-21 生成的 NK 細胞。總之，這些數據支持這樣一種觀點，即 NK 細胞激活的三信號模型能夠使 NK 細胞穩健擴增并具有更強的抗腫瘤效力。

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為了深入了解 NK 細胞中伴隨 uAPC 刺激的轉錄組學和信號通路，我們在與 uAPC 共培養后的第 0 天（基線）和第 15 天對純化的 NT 和 CAR NK 細胞進行了 RNA 測序研究。uAPC 刺激導致 NT 和 CAR NK 細胞中 IL-21 受體基因 (IL21R) 的下調（圖 4A），這與 IL-21 驅動 NK 擴增（15）并調節 NK 細胞受體表達的報道一致（22 ）。另一方面，在用 uAPC 刺激后，TNFRSF9 (4-1BB) 在 NT 和 CAR NK 細胞中被顯著誘導（P

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暴露于uAPC（第 15 天）后NT和 CAR NK 細胞的轉錄組學分析顯示，與基線（第 0 天）相比，與效應子功能相關的基因上調。重要的是，我們沒有觀察到任何與疲勞、無反應性或衰老相關的途徑（圖 4B）。在uAPC刺激的NT和CAR NK細胞中，與細胞周期、細胞膜形態和代謝途徑相關的基因同樣增加（圖 4C）。基因集富集分析 (GSEA) 揭示了 uAPC 激活的 NT 和 CAR NK 細胞中涉及 E2F 靶標、糖酵解、氧化磷酸化和脂肪酸代謝的基因的富集（圖 4D）。

特別值得注意的是，這些代謝動員模式與脂質生物發生和細胞膜重組相一致，表明了一個活躍的程序，表明細胞增殖以及NK細胞內效應器成分的啟動以準備細胞毒性活動。二維主成分分析 (PCA) 的特征值截止值為1和2，可以通過其不同的狀態輕松區分樣品，進一步支持我們擴增的 NK 細胞的非克隆性質。

接下來，為了評估與NK細胞中uAPC擴增相關的表型變化，我們使用了飛行時間 (CyToF) 細胞術和一組 36 種針對抑制性和激活性受體的抗體，以及分化、歸巢和激活標記物。我們鑒定了20個不同的 NK 細胞簇，它們表征靜息、uAPC 擴增的 NT 和 CAR NK 細胞（圖 5A、B）。靜息 NK 細胞主要由 16-20 簇組成，而簇 1-5 僅在擴增的 CAR NK 細胞中觀察到，簇 6-15 由擴增的 NT 和 CAR NK 細胞共享（圖 5A、B）。uAPC 擴增的 NT 和 CAR NK 細胞均顯示出激活和細胞毒性標志物的表達增加，包括顆粒酶 A (GrA)、顆粒酶 B (GrB)、穿孔素；與靜息 NK 細胞相比，轉錄因子（Eomes、T-bet）和激活受體（NKp30、NKG2D、2B4、CD94/NKG2C）（圖 5C、D）。總之，這些數據表明 uAPC 培養增強了 NT 和 CAR NK 細胞的活化和抗腫瘤活性，同時保留了它們的 CAR 特異性。

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為了在 cGMP 環境中使用 uAPC 來生成基于 NK 細胞的治療產品，我們根據當前的最佳實踐基于發布標準進行了一系列驗證運行。我們建立并分析了表 1 中列出的釋放標準，包括無菌性、活力、特性和效力，如所示滿足監管要求。此外，還建立了處理和使用 uAPC 以促進 NK 體外擴增用于臨床生產的標準操作程序，以幫助質量保證和質量控制。作為我們確保 uAPC 在臨床使用中的完整性的努力的一部分，我們還對 uAPC 進行了遺傳指紋識別，并表明 STR 譜與 K562 親本譜系相匹配。

在制定和建立 GMP 級 uAPC 的發布標準后，我們在 GMP 實驗室驗證和表征了 NK 細胞擴增過程。與在使用前按需生長和輻照的研究級 uAPC 批次相比，臨床級 uAPC 批次會根據需要進行膨脹、輻照、冷凍保存和解凍以備使用。與研究級 CB NK 細胞（圖 3A）類似，GMP 級 CB NK 細胞產品在與 GMP 級 uAPC 共培養后第 14 天和第 21 天顯示出強勁的擴增（>1,000 倍）（圖 6A）。重要的是，用 GMP 級 uAPC 擴增的 NT 和 iC9/CAR.19/IL-15 (CAR) NK 細胞具有出色的純度，檢測到低頻率至零 T 細胞（0.01-0.04%）（圖 6B、C）。在我們的臨床 NK 細胞產品中，低 T 細胞污染是預防 GvHD 的必要條件。此外，擴增的細胞群是 CD45+ CD32-，表明沒有 uAPC 細胞生長（圖 6B、C）。與 NT 對照相比，使用 GMP 級 uAPC 刺激的 iC9/CAR.19/IL-15 (CAR) NK 細胞對 Raji 淋巴瘤細胞發揮更大的細胞毒性（圖 6D），而 uAPC 刺激的 NT 和 iC9/CAR.19/IL -15 (CAR) NK 細胞在殺死 K562 靶標方面同樣有效（圖 6D）。一旦臨床級 uAPC 在 GMP 實驗室得到驗證，就建立了一個主細胞庫，并在正在進行的 I/II 期臨床試驗中為我們獲得了 FDA 的批準。

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在未經處理的臍帶血或外周血單核細胞部分中發現的 NK 細胞數量相對較少，限制了 NK 細胞免疫療法的治療應用。因此，NK細胞的體外擴增已越來越多地用于產生臨床相關劑量。

雖然包括 IL-2 在內的細胞因子混合物已被用于激活和擴增 NK 細胞，但這些策略不能產生足夠數量的 NK 細胞用于臨床。這是因為細胞接觸對于驅動有效的離體 NK 細胞擴增至關重要。許多基于 K562 的人工 APC 系已被描述并用于擴增原代 NK 細胞、NKT 細胞、多種 T 細胞亞群和腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL)以及 CAR 轉導的淋巴細胞。

跨膜 4-1BB 是目前最常用的共刺激受體，可與 CD80/86 以及 IL-2、IL-15 和 IL-21 的各種組合一起擴增 NK 細胞。我們的方法利用獨特的SLAMF介導的NK細胞免疫雕刻來優化臨床應用的產品。我們的目標是確定一組最小的抗原刺激，足以在 2-3 周內觸發研究和臨床級 NK 細胞的最佳體外擴增。選擇 K562 腫瘤細胞系作為刺激細胞，因為它們，(1) 大部分缺乏 MHC 決定簇，因此對 NK 細胞的細胞毒性敏感，(2) 在懸浮培養中生長，易于與 NK 細胞的相互作用，(3) 具有相對18-24 小時的短倍增時間和 (4) 很容易且穩定地被逆轉錄病毒轉導，以根據需要強制表達抗原。

NK 細胞中的“信號 1”沒有已知或簡單的替代品（例如 T 細胞中的 TCR-MHC 相互作用）。NK 細胞和靶細胞之間直接物理相互作用的啟動極大地影響了 NK 細胞在殺死或保留靶細胞方面的反應。因此，我們建議由 KIR 識別 uAPC 上 HLA I 類缺失介導的“失蹤自我”相互作用是 NK 細胞中“信號 1”反應的最接近替代物。為了誘導信號 2（輔助受體）引發的細胞相互作用，我們考慮使用來自同源免疫球蛋白受體的信號淋巴細胞激活分子（SLAM，以前也稱為CD2超家族）的抗原，這些受體廣泛表達并在免疫系統中發揮關鍵作用，具有細胞間相互作用的一個特別重要的特征。我們使用CD48作為uAPC中的替代“信號 2”來啟動與NK 細胞的細胞間相互作用。CD48是一種存在于細胞表面的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白 (GPI-AP)，參與免疫細胞的粘附和激活途徑。盡管缺乏細胞內結構域，CD48 的刺激會誘導脂筏中信號因子的重排、Lck 激酶活性和酪氨酸磷酸化。作為粘附和共刺激分子，CD48是2B4的反受體，2B4是NK細胞的重要激活劑。

我們還使用4-1BB配體作為第二個“信號 2”來介導NK細胞增殖和分化。值得注意的是，4-1BB在我們在第15天收集的 uAPC 刺激的NK細胞中顯著上調（圖 4A）。在活化的 NK細胞中，CD137是一種細胞因子誘導型共刺激分子，它反過來通過增加細胞增殖和 IFN-γ 分泌來驅動 NK 細胞的抗腫瘤反應。使用CD137L-/- 基因敲除小鼠的研究表明 CD137/CD137L 信號軸在抗腫瘤免疫細胞發育中的重要性。CD137在調節 NK 細胞介導的抗腫瘤作用中的關鍵作用在CD137-/- 基因敲除小鼠中很明顯，與對照小鼠相比，這些小鼠的腫瘤轉移頻率高4倍。4-1BB配體（4-1BBL、CD137L）形成同源三聚體胞外域，具有獨特的三葉螺旋槳構象，不同于腫瘤壞死因子 (TNF) 超家族其他成員形成的三聚體，暗示功能性分子信號的差異。雖然可以用抗4-1BB 抗體刺激NK細胞上的4-1BB，但我們選擇了4-1BB配體 (41BBL)，CD137的生理反受體，以獲得最佳刺激。

細胞因子信號傳導對于維持淋巴細胞存活、增殖和效應器功效也至關重要。體內 IL-2 給藥是FDA批準的用于在患者體內擴增免疫細胞的唯一方法。認識到細胞因子刺激對 NK 細胞健康的重要性，我們的“信號 3”策略是將mbIL-21封裝為 uAPC 的一部分。對于基因工程化以表達 CAR 的 NK 細胞，我們編碼了一個用于組成型自分泌分泌的 IL-15 表達盒。

雖然 γc 細胞因子受體在許多免疫細胞中共享類似的細胞信號成分，如 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21 受體，但人類 NK 細胞特異性信號非常依賴于 nt 對 IL-21 受體-STAT3 增殖關系的影響。STAT3 是一種高效的 NK 細胞增殖激活劑，能夠誘導 NKG2D 表達。在 Stat1/Stat3 雙基因敲除小鼠中，IL-21 反應減弱強調了 IL21R-STAT3 關系。為了有效利用 IL-21，我們在 uAPC（圖 1A）上強制表達膜結合 IL-21（mbIL21），以集中和定位它們與 NK 細胞上的 IL21R 的反式相互作用。以前，與使用我們的 uAPC 的 2 周相比，與受照射的 K562-mb15-41BBL 共培養 3周后，外周血中的 CD56+CD3- NK 細胞擴增中位數增加了 1,000 倍。與僅用來自共享 γc 家族的可溶性細胞因子（包括 IL-2、IL-12、IL-15、IL-21 單獨或組合）刺激相比，這種擴增更高。相比之下，對于非轉導和 CAR 轉導的 NK 細胞，我們能夠在 14 天內將 NK 細胞擴增多達 1,000 倍（3-log）。與使用先前報道的 K562 擴增的 CAR NK 細胞相比，CAR NK 細胞在殺死 CD19 陽性靶標（例如 Raji、Daudi 和原代 CLL 細胞）方面非常有效 (44)，并且在淋巴瘤異種移植小鼠模型中發揮抗腫瘤活性的能力更強衍生的 APC (C9/IL-21) 僅表達 4-1BBL 和 mbIL21 (15)，支持 NK 細胞激活的三信號模型可以支持 NK 細胞擴增的觀點。值得注意的是，uAPC 飼養細胞還可以有效地擴增僅表達 CAR19 的 NK 細胞，而無需 IL-15 轉基因 (44)，進一步證明了其通用性。

雖然我們注意到與 uAPC 孵育后 NT 和 CAR NK 細胞中 IL-21R（圖 4A）的下調，但這種觀察的機制仍有待確定。能量學（糖酵解、氧化磷酸化和脂肪酸代謝）和脂質生物發生基因的動員符合增殖 NK 細胞的代謝特征 (44)。重要的是，缺乏與衰竭、無反應或衰老相關的生物標志物（圖 4B）支持我們生產準備靶向癌癥的 NK 細胞的目標。此外，通過質譜流式細胞術對 NK 細胞的表型分析（圖 5）產生了獨特的靜息和激活 NK 細胞群，表明非克隆擴增。?

總之，我們的適應性強且強大的 uAPC 平臺不是僅僅依賴商業供應商提供關鍵生物試劑，這可能導致不可預測和有害的供應鏈中斷，而是在一個緊湊的包裝中提供必要和預期的 NK 細胞刺激，以供持續臨床使用。我們表明，在存在或不存在 CAR 的情況下，表型不同的 NK 細胞亞群可以使用最少的通用抗原刺激劑在體外進行最佳擴增和塑造，以觸發類似于 T 細胞激活的三信號模型的信號軸。我們的模型利用“失蹤的自我”相互作用作為信號 1，CD48-2B4 和 CD137-CD137L 共刺激相互作用作為信號 2，IL-21 細胞因子作為信號 3。

我們已經跨越了uAPC 的臨床前轉化表征，已經在 GMP 環境中驗證了生產，目前正在MD Anderson臨床試驗中使用臨床級 uAPC生產 NK 和 CAR-NK 細胞（NCT 編號：NCT03056339）。作為原理證明，我們表明uAPC可以為靶向CD19抗原 的CAR NK生產提供動力，該抗原用于靶向 B 細胞惡性腫瘤。未來的計劃包括擴大 CAR-NK 的使用，以針對包括實體瘤在內的各種抗原和適應癥。