用于T淋巴細胞規模擴增的生物反應器系統

最近，FDA 批準了幾種 CAR T 細胞治療藥物，第一個是tisagenleucel（商業名稱Kymriah?），于 2017 年底用于治療難治性B細胞前體急性淋巴細胞白血病。緊隨其后的是用于治療大B細胞淋巴瘤的 axicabtagene ciloleucel (Yescarta?)，后來又出現了其他藥物，例如brexucabtagene autoleucel（Tecar tus?）對抗套細胞淋巴瘤。

過去幾十年開發的擴展程序為I/II期發展研究帶來了出色的結果,特別是，使用生物反應器是一種用于過繼轉移T細胞體外培養的有前途的方法。生物反應器被定義為在受控環境中裝有細胞、其他生物體和/或生物活性物質的容器：仔細監測溫度、營養物質、廢物、pH、機械要求和流速以實現多種生物技術過程（圖 1）。開發了許多生物反應器設計來滿足這些不同研究領域的特定要求。

生物反應器的方法仍處于起步階段，過去10年的文章數量似乎達到了平臺期（圖 2）。這一現象凸顯了對新方法、發現和優化的迫切需求，以進一步實現基于生物反應器系統的臨床規模生產。

在本文中，首先介紹了對T細胞培養和治療的一般考慮，包括對除擴增之外的其他步驟的簡要概述。然后討論了特定的T細胞培養要求，以強調指導新擴增過程開發的主要目標和方法。最后，報告了當前的黃金標準，即培養瓶和移動培養袋，并與主要的生物反應器設計進行了比較，即中空纖維、袋式生物反應器和改進的燒瓶系統，以及原始和最近的建議。

有一系列方法可用于在T細胞過繼轉移后產生強大的治療作用。用于細胞治療的TIL制造通常需要標準的體外擴增步驟：TILs從腫瘤活檢中分離、洗滌和濃縮，然后擴增至臨床相關的回輸規模。然而，TIL并不總是自然存在，只能從某些患者身上產生。因此，已經開發了基于T細胞受體 (TCR) 或嵌合抗原受體 (CAR) 的其他策略。

通過這種方法，來自患有其他癌癥的患者的正常T細胞通過單采分離并轉導以產生TCR或CAR T細胞（圖 3）。

必須執行激活程序以允許制造的T細胞的轉導和增殖。T細胞激活和增殖的完整環境包括抗CD3抗體和外源性IL-2，以及作為飼養細胞的外周血單核細胞。這種組合被報告為標準的“快速擴展協議”（REP）今天仍在研究如何改進和完善REP，例如使用額外的培養基補體（IL-7、IL-15、抗 CD28 抗體）以及使用專注于pp65蛋白的肽混合物進行預刺激，導致在同一培養容器中獲得更高的增殖率。

由于記憶T細胞，為了在快速移植、抗腫瘤活性和長期保護方面獲得最佳結果，已經表明需要大部分CD8+，但有一些CD4+ 細胞高于閾值（經典培養條件下的研究） 以及如下所述的Wave系統。此外，有人認為CD4+ T細胞在體內更有效：CD4+ T細胞與 CD8+ T細胞具有相同的細胞毒活性；然而，CD4+子集在TCR參與后更加持久。用于治療的最有效T細胞亞群尚未確定。

所使用的抗體對產生的 T 細胞的治療質量也有很大影響。與CD28共刺激相比，表達4-1BB的基于細胞的人工抗原呈遞細胞增加了CD8+T細胞的擴增。

由于T細胞活化涉及許多因素，很明顯，任何涉及活化步驟的生物反應器都應評估其對T細胞與抗原呈遞相互作用的影響。例如，攪拌以改善生物反應器中的傳質可能會顯著影響T細胞活化。

盡管出現了此類標準化程序，但仍在研究基于專用培養系統的更復雜環境，以獲得最佳增殖，從而產生足夠的TIL或TCR/CAR細胞用于治療。為了更進一步，必須了解該譜系的培養要求、持續的挑戰以及生物反應器擴展的具體目標。

3.1.細胞數

如前所述，開發用于培養T細胞的生物反應器系統的主要目標是與靜態燒瓶培養相比，進一步提高體外增殖率，超越REP和激活步驟。分離細胞的數量仍然太少，無法確保有效的自體免疫治療。在兒科和年輕成人CAR T試驗中，開發了一種復雜的算法和方法，以實現預期的32.4億CD3+T細胞單采。對于最終的治療產品，大多數研究報告稱一名患者需要1-1000億個細胞。

在本文中，將討論在特定類型的設備中可以實現的最大細胞密度和最大產量。然而，必須注意的是，系統之間的設計和功能差異，例如中空纖維生物反應器和攪拌罐系統，使得在不考慮所有其他特征和參數的情況下很難或幾乎不可能嚴格比較最大細胞密度。因此，在評估生物反應器在T細胞應用中的潛力時，它不應該是唯一要考慮的參數。

3.2.降低成本和數量

增殖率的提高將有助于減少溶液量和勞動時間，進而減少細胞療法的成本。事實上，T 細胞擴增通常在經典條件下持續14天和由于細胞密度低，可能需要數十升培養基才能獲得所需數量。因此，優化生物反應器設計以減少體積并改進T細胞培養物的補料計劃以在營養支持、廢物去除和培養基成本之間找到平衡至關重要。

此外，已經表明部分培養基改變可以改善細胞擴增，因為完全改變導致去除所有有益的自分泌因子，如干擾素-γ、IL 1β和腫瘤壞死因子-α，導致增殖減少。然而，相反，開發復雜的生物反應器系統可能會增加采購和啟動成本，特別是對于參與設計和優化早期步驟的小型學術結構。因此，在評估生物反應器的經濟利益時，需要仔細考慮這種平衡。

3.3.促進符合良好生產規范 (GMP) 的協議

由于當前 T 細胞擴增方案的高勞動強度，促進確保GMP的過程非常重要。如前所述，減少體積和培養步驟對此類方法以及自動化有積極貢獻常規程序和封閉系統的使用。生物反應器的設計應避免細胞群在擴增期間多次暴露于外部環境，用于進料和取樣以及從一個培養系統轉移到另一個培養系統消除了對潔凈室等大型設施的需求。GMP還應應用于初始和輔助步驟，例如 TCR/CAR 細胞的冷凍保存或轉導過程，從而促進將研究轉化為臨床試驗。

4.1.基于中空纖維膜的生物反應器：Terumo Quantum

首先中空纖維濾芯在40多年前開發用于透析系統（圖 4A），后來被提議用于細胞培養和進一步應用并最終成為生物反應器。早些年，中空纖維中的一些T細胞相關研究并不關注細胞擴增。中空纖維創造了一個兩室培養環境，因為細胞在小中空纖維（直徑200μm）的一側生長，而培養基在另一側灌注（圖.4B）。纖維由可滲透特定目標成分（生物分子、氣體、營養物質、廢物）的膜制成，因此允許細胞隔室和培養基灌注之間的受控交換。

將此類系統應用于T細胞培養的基本原理是由于分隔幾何結構，避免了由流動灌注引起的剪切應力，同時保持介質運動，如在搖袋和攪拌罐中，有機會重新充氧并調節培養基pH值，然后再將其送回細胞。此外，細胞室中培養基的閉環和營養物質的濃度有助于減少喂養所需的體積。此處關于細胞密度的方法是在固定體積（細胞室）中增加濃度，但是流速可以隨著細胞數量而增加。

這種系統的一個潛在問題是要提供或去除的分子的大小，尤其是隨著細胞密度的增加。T細胞逐漸產生的抑制物的生長必須很容易去除 確保持續增殖和擴張，這可以通過纖維膜實現，如早年所示。以類似的方式，生長因子應該能夠反過來從灌注到達細胞區域。因此，擴增所需的T細胞特異性激活因子（即推薦遵循REP的IL-2和抗體）的分子量將指導要使用的膜的選擇。例如，特里克特等人。注意到聚丙烯基中空纖維（制造商列出的0.3-0.5μm 膜孔徑）比4kDa纖維素濾芯更適合IL-2擴散。

以中空纖維為中心的生物反應器系統的一個商業示例是Terumo Quantum?。該系統能夠在系統中的一個一次性使用套件內將T細胞培養到治療劑量；接種1×10^8個淋巴細胞后，它能夠使細胞數量增加 90-500倍。因此，在使用Quantum?系統的實驗中，起始細胞數量非常高，并且起始材料質量可能是 T 細胞過繼轉移的一個挑戰。可能需要進一步研究該系統對起始材料參數（如細胞數）變化的適應性，以確認其全部潛力。

T細胞與稱為Dynabeads的聚合物顆粒的共培養經常用于中空纖維、波浪袋和攪拌罐生物反應器形式的活化步驟。對于中空纖維形式，由 T細胞的dynabead激活和Quantum?擴增產生的CD4+:CD8+比率高度依賴于供體材料。大多數樣本傾向于促進CD8+細胞的增殖；然而，對于一名捐助者，該比例接近1:1。

改進初始結果，Quantum?系統中的優化方案發現，除了其他參數的變化外，增加每個T細胞的dynabeads數量會導致生物反應器產生更高的倍數擴增。該研究未報告對T細胞表型的影響。關于生物反應器產生的T細胞亞群的結論是，它可能依賴于與生物反應器無關的因素，但例如與供體變異性相關的因素，盡管這些研究缺乏與使用上述金標準方法的對照實驗相關的數據.

Quantum? 和中空纖維生物反應器的一個獨特之處在于它們能夠培養貼壁細胞，因此也可以生產用于轉染CAR T療法的慢病毒載體。

此外，由于中空纖維系統已用于細胞培養以生產細胞分泌產物，因此有良好的行業基礎設施來支持該系統，同時承認在培養結束時收獲細胞的要求可能會帶來一些挑戰。

4.2.改進的燒瓶：G-Rex? 系統

常規培養T型燒瓶的優點是易于使用且價格合理。因此，開發更具相關性但易于監測的培養環境的一種方法是設計具有附加功能以提高增殖率的“改進燒瓶”。盡管可以理所當然地討論此類設備的生物反應器性質，但根據生物反應器的嚴格定義，它們確實可以被視為具有微控制環境的容器，特別是通過氣體交換。

用于透氣性快速膨脹的G-Rex?系統大約在10年前由Wilson Wolf Manufacturing開發，作為T型燒瓶、旋轉燒瓶和半滲透袋的替代品。該細胞擴增室的主要特征是位于底部的半透膜與主要細胞培養表面區域接觸（圖 5）。與常規T型燒瓶相比，該容器可以填充非常大容量的培養基，其中限制為1mL/cm2以避免細胞缺氧。該裝置已經過懸浮細胞測試，可以與 REP 結合使用，包括添加飼養細胞。因此，它被考慮用于T細胞的擴增。根據制造商的信息，較大的初始體積以及對細胞傳代和培養基變化沒有特定要求意味著在恒定體積中增加細胞密度以進行 T 細胞擴增。G-Rex? 燒瓶已使用不同的協議作為半開放或封閉系統進行了研究。

4.3.改進的培養袋：波浪生物反應器和GE Xuri系統

Wave生物反應器最初由Singh等人開發。1999年作為替代生物反應器，與以前的系統相比，可以輕松擴大規模。它被提議用于各種應用，例如貼壁和非貼壁細胞培養以及腺病毒生產。然后最近專門研究了T細胞的擴增。

該系統使用無菌一次性培養袋作為平臺上的主要容器，確保加熱和搖擺運動（可變角度、幅度和速率）以在培養基中誘導“波浪”（圖 6）。即使在小體積的高細胞密度下，這些特定的運動也能提供更好的氧交換、均勻性和易于獲取營養物質，同時與攪拌系統相比減少了對細胞的壓力。培養基可以通過袋子灌注，標準管道端口允許采樣和接種。該生物反應器已成功用于 I 期和 II 1期臨床試驗。因此，與靜態和單軸振動袋相比，該系統的主要創新特征是在封閉系統中將復雜的波回路與流動灌注相結合。這種組合即使在細胞尺度上也能提供更好的均質性，因為它避免了位于細胞附近環境中濃度最高的有益分泌因子的梯度。因此這是一個更復雜的 從技術的角度來看，系統比當前的黃金標準要好，但實際上它不會增加勞動時間，因為監測和采樣很簡單，甚至是自動化的。

此外，REP 過程的所有步驟都可以直接在系統中進行，而只有 REP 的后期階段才適合在其他設計中運行，例如基于中空纖維膜的生物反應器。除了增加增殖率外，這種方法還可以通過縮短培養過程來提高標準產量，這要歸功于更容易處理和監控。

使用透明培養袋本身就是一個優勢，因為它們是一次性的，可以消毒，光學透明，并允許通過培養基進行顯微鏡觀察和非侵入性光學測量。

由于這些特點，Wave 生物反應器已被用于 T 細胞擴增，采用恒定體積和增加細胞密度的方法，結合流動灌注，其方式與中空纖維生物反應器類似.然而，由于單獨的搖擺運動提供了混合和氧氣交換，因此可以研究一種混合方法來使參數適應細胞密度：Sadeghi 等人。使用恒定體積，但只有在達到一定的細胞密度后才開始灌注培養基。更重要的是，他們表明，當該過程以較小的體積開始時，細胞擴增的結果會更好。因此，可以通過將增加的體積與基于細胞密度或營養水平（谷氨酰胺和葡萄糖）的流量灌注相結合來開發另一種方法。有趣的是，除了可用體積外，所有參數都可以在細胞增殖時隨時間調整，例如搖擺率、搖擺角、灌注流速等。

總體而言，Wave 生物反應器獲得的增殖率與靜態袋法相似或顯著高于靜態袋法，并且需要的體積更小。

除了擴增后的細胞數量外，還根據表型分析了Wave生物反應器中的 T 細胞群，重點是CD4+和CD8+ 細胞之間的平衡。?

無論如何，使用該系統存在一些限制。與靜態小規模工藝相比，需要許多優化步驟，涉及基本培養參數以及 Wave 生物反應器特有的不同技術參數。這種優化可能很困難，因為它們會產生各種影響：例如，搖擺率會改變剪切應力，但也會影響曝氣，從而影響氧氣交換。與其他系統相比，初始購買可能是一筆更大的投資，但這可能會有所不同，因為由于培養基體積減少，常規培養會更便宜。由于該系統是多個運動和灌注的組合，電氣和機械故障改變細胞行為的風險更為重要，因此設置需要很強的冗余。

4.4.單系統多步驟生物反應器：Miltenyi Biotec Clinimacs Prodigy

鑒于生物反應器是在生物過程中轉化物質的系統的總稱，一個完整的生物反應器系統可能能夠在先進的治療生產線中執行多個步驟。

一種這樣的設備 Miltenyi Biotec Clinimacs Prodigy系統。該系統能夠在一件硬件及其相關的一次性管組內執行細胞選擇、激活、轉導、擴增、細胞收獲和配制。

在Mock等人的研究中，Prodigy中獲得的結果與GMP設施中使用的過程相當：Prodigy的細胞數量、活力和無菌性結果既沒有改善，更重要的是，與比較中獲得的結果相比有所下降。過程（包括培養袋和Wave 生物反應器）。這表明系統的好處在于一個系統中多個步驟的自動化。該系統的某些部分不僅在執行操作時通過預編程實現自動化，而且在某種程度上還受到控制：壓力和液體傳感器可以檢測新任務何時完成；攝像頭可以在離心步驟中監測細胞分離的進程；顯微鏡可用于評估細胞培養的進展。封閉在一個設備中的多個步驟可能會減少潔凈室空間并允許在衛星位置進行生產，這有助于實現分散制造過程的好處。

Mock 等人繪制的表格。表明 Prodigy 執行的許多步驟仍然需要操作員交互，因此，它不是一個完全自動化的系統。此外，在單一系統硬件中提供多種功能可能存在缺陷。無論培養系統如何，細胞擴增都是基于T細胞的免疫療法生產的最長階段，假設可以有效地提供慢病毒載體 。較長的細胞擴增步驟意味著當Prodigy在細胞擴增階段運行時，離心和細胞分離功能保持閑置。這并不理想，考慮到這些療法目前是自體的，因此，該設備可用于為單獨的患者處理材料。允許在先進療法制造的各個步驟出現瓶頸，單系統多步驟生物反應器可能會因硬件可用性不足而限制生物加工鏈的吞吐量。這將鼓勵未來的多步生物反應器基于所有處理鏈的吞吐量分析，從而最大限度地減少瓶頸的影響。

該系統的另一個顯著缺點是其容量有限，這可能會限制其在生產多劑量治療中的使用以及在生產同種異體治療中的使用。培養容器與用于離心的單元相同，這表明這種多次使用可能不是細胞培養的最佳設計。

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4.5.攪拌系統和自制設計

另一類生物反應器和動力學容器是旋轉燒瓶和進一步攪拌系統（圖 7）。通過機械或磁力攪拌，它們的主要優點是提供簡單的幾何形狀，以提供均勻的培養條件和出色的氣體交換，并且易于采樣。市場上有不同的型號，并且可以通過增加儲罐的體積輕松進行放大。灌注可以增加攪拌罐內實現的細胞密度，減少擴大細胞產量所需的體積。然而，克羅普等人研究的灌注。需要額外的硬件來保留生物反應器內的純細胞干細胞聚集體。攪拌罐還允許在培養過程中使用 REP并且主要用于恒定的培養體積。

為了優化此類系統中培養的受控環境，需要調整的主要參數之一是攪拌機制的速率。高攪拌速率產生的剪切應力確實會危及培養基混合對細胞增殖的有益影響。例如，Foster等人已經研究了轉速對 T 細胞培養的影響以及與基于噴射的曝氣相結合。旋轉燒瓶中高達120 RPM的速度范圍或大規模 (2 L) 攪拌生物反應器中高達180 RPM 的速度范圍在不改變細胞活力和增殖的情況下得到了成功。

除了速度外，如果在靜態條件下優化后需要，還可以在攪拌系統中監測或控制許多其他參數，例如滲透壓、IL-2 濃度、pH、氧張力和進料計劃。可以通過修改整體培養方案以及攪拌機制來減少剪切應力的影響。Bohnenkamp等人研究了攪拌生物反應器中的不同進料策略后。表明每天更新一小部分培養基（不超過總體積的一半）比每2/3天進行一次更大的變化會導致更高的增殖率，最糟糕的方法是完全更新去除廢物和旁分泌因素。因此，攪拌生物反應器的一個缺點可能是需要頻繁干預介質更換，限制了封閉系統的潛力。我們可以建議將攪拌容器與培養基灌注相結合，但據我們所知，這種方法并未廣泛研究用于 T 細胞擴增，盡管最近已經報道了例如干細胞。

事實上，攪拌罐生物反應器在其他細胞譜系的擴增方面已經顯示出非常好的結果，特別是誘導多能干細胞 (iPSC)，免疫細胞可以在體外衍生。這些方法不僅可以為免疫療法的替代體外擴增鋪平道路，而且基于 T 細胞的過程也可以從其他細胞類型的進展中受益。

迄今為止，T細胞培養生物反應器尚未達成任何共識，并且針對封閉和自動化系統存在許多不同的改進方法。培養基和氣室由可滲透氣體但不可滲透液體的膜隔開（圖 8），在培養過程中對兩相進行灌注。培養基由 7 升存儲庫提供，用于14天的增殖步驟，從而形成一個完全封閉的系統。流速隨著時間的推移和批次間的變化進行調整，以將乳酸濃度保持在0.5和1mg/mL 之間，緩慢和層流，對細胞懸浮液無害。該過程允許使用REP，特別是在第0天以單次推注形式注射IL-（確認封閉系統潛力）和低血清濃度，與進一步的臨床驗證相關。

新穎的設計可以提高生物反應器的擴展能力，盡管它們仍然存在限制它們在治療制造中采用的局限性。

總之，作為總體結果，與靜態標準相比，大多數研究的系統在 T 細胞增殖方面表現出更好的結果；或者，在類似結果的情況下，提高了易用性并降低了成本和勞動時間（表 1）。

本綜述中提出的質量源于設計(QbD)和實驗設計(DoE)方法將成為執行這些多參數研究的有益工具，以真正了解自體細胞療法生產中的設計空間和操作條件。這些未來的研究還需要確定細胞擴增生物反應器及其新功能如何影響QbD原則。此外，由于REP條件廣泛用于生物反應器方法，將結果與不使用REP的對照組（即沒有觸發 T 細胞活化和增殖的因素的基礎培養基）進行比較可能會很有趣，以便研究REP和特定生物反應器特征之間可能的協同作用。這甚至可以突出先進的系統，其中可以減少激活步驟以獲得相同的擴展范圍，從而降低成本和勞動力。

通過使用生物反應器，可以更好地控制上述細胞培養過程中的參數。然而，由于復雜的T細胞生物學，T細胞擴增中使用的參數對所得細胞群的影響并不總是很清楚。因此，我們建議從生物反應器的初始設計和部署到生物過程中采用實驗設計(DoE)方法。這種方法將允許識別影響生物反應器執行過程的所有參數，并了解如何通過有效使用實驗運行來改變參數以影響輸出。此外，很明顯，生物反應器可以影響治療細胞的許多質量屬性。這種多屬性影響需要了解設計質量 (QbD)，考慮到細胞產品將有不止一個因素決定其作為治療劑的成功，這應該從初始設計階段開始考慮。這種方法將擴展生物反應器研究，以包括生物反應器產生的細胞的所有治療質量方面，而不僅僅是反應器產生大量細胞的難易程度。

除了增加增殖外，對于各種生物反應器，最終目標通常是設計一個完全封閉的系統以符合GMP，但也向全自動系統邁進。例如，它可以作為 Wave生物反應器的可選模塊來控制介質交換。由于多次干預，自動化設備減少了勞動工作和污染風險，但這也是獲得具有批次間可靠性的標準結果的最佳方法。確實建議使用生物反應器的標準化條件來限制批次差異。

然而，通過預編程設定任務的自動化不允許系統響應偏差。可以通過引入分析技術和過程控制方法來生產改進的系統。技術瓶頸是開發無創和實時分析細胞培養參數的方法，例如細胞濃度、pH、乳酸濃度或耗氧量，這些方法可以嵌入濕潤的 37℃大氣中。測量將用于自動調整技術參數，如搖擺運動、速度、流速、介質更新或在體積增加的情況下注入。這使治療生產生物反應器系統遠離自動化，通過對任務進行預編程，目前是通過對上述系統的審查而建立的規范，并轉向閉環控制，這是一個更強大的工程支柱。傳感器和執行器不應顯著增加成本或降低安全性，從而危及生物反應器在增殖率和GMP 合規性方面的優勢。

有了檢測質量屬性的合適方法，就面臨著實施提供反饋的方法的挑戰，以便可以通過改進處理方面來抵消監控設備的成本。需要對自體治療環境中的在線傳感和控制反饋進行成本效益分析，以了解這些方法是否可以在自體治療制造規模上產生有價值的改進。

當細胞構成治療的一部分時，批次間的變異性是一個已知問題，從我們上面的回顧來看，很明顯，當前一代生物反應器可以穩定參數并自動為每批擴增的細胞在相同的程序中執行任務無論使用的確切設計如何。然而，它們中的許多缺乏閉環控制來響應不斷進行的細胞擴增，不同批次的進展速度可能會有很大差異，這在本文中引用的生物反應器研究中得到了廣泛報道。缺乏控制的原因與缺乏傳感器和已建立的方法來執行細胞擴增過程的在線采樣有關。

為了進一步邁向臨床，考慮附帶步驟也很重要，例如在使用冷凍保存細胞時如何改變生物反應器的產量和活力。額外的恢復期可能必須包括在培養計劃中。

總之，雖然大多數報告的系統顯示出比當前黃金標準更高的增殖率，但目前尚未就獲得臨床相關T細胞數量的最佳生物反應器方法達成共識。然而，最佳細胞密度和增殖率并不是確保轉化進展的唯一目標：自動化、過程控制和完整的封閉系統仍未實現最終目標，但如果從開發的早期階段考慮，可以逐步實施，因為它是 以前做符合GMP和REP，現在廣泛使用。建議使用過程工程方法來幫助克服實施新一代生物反應器技術的挑戰。