如何激活人體免疫“第一反應者”—NK細胞

圖 | NK 細胞（黃色部分）攻擊腫瘤細胞（紅色部分）圖示（來源：Science）

撰文：南宮明月

來源：干細胞者說

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自然殺傷細胞（Natural killer cell，NK細胞?)，是腫瘤和病毒感染免疫中的“第一反應者”，可自發識別體內異常細胞，并通過細胞毒性作用將其迅速清除，同時產生各類促炎細胞因子和趨化因子，招募和激活其他免疫細胞以啟動適應性免疫反應。

NK細胞已經成為抗腫瘤免疫治療的重要靶點。今天，我們來了解一下如何激活人體免疫“第一反應者”——NK細胞。

–01–

NK細胞激活機制

NK細胞是由一系列激活和抑制受體轉導的信號之間的動態平衡調節的。正常細胞表面通過表達MHC-I分子，引發NK細胞的抑制性信號傳導，避免NK細胞的攻擊。

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然而，病毒感染的細胞或腫瘤細胞通常下調MHC-I的表達，逃避依賴于檢測MHC-I呈遞的抗原肽的CD8+T細胞的識別。相反，這種MHC-I抑制性受體配體的缺失和/或活化受體配體的上調，可使NK細胞激活，從而引發NK細胞的自發攻擊。NK細胞激活后，通過釋放大量的穿孔素和顆粒酶來誘導靶細胞凋亡。

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NK細胞殺傷腫瘤細胞主要通過以下四種方式完成，分別是：

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▉?直接殺傷

NK細胞直接通過胞吐作用，釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性顆粒，穿孔素在靶細胞表面穿孔，使顆粒酶進入靶細胞誘導靶細胞凋亡。

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▉?誘導細胞凋亡

活化NK細胞表達Fas（CD95）配體和TRAIL（腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體）分子，誘導CD95+靶細胞和TRAIL受體陽性的靶細胞通過內源酶的級聯反應發生凋亡，使靶細胞進入程序性凋亡狀態。

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▉?細胞因子介導殺傷

NK細胞能合成和分泌多種細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL1、IL5、IL8、IL10和G-CSF等），直接作用于靶細胞，或通過進一步激活其他種類免疫細胞攻擊靶細胞。

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▉?抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）

NK細胞低親和力的CD16分子與靶細胞IgG抗體復合物結合后，活化蛋白酪氨酸激酶（PTK），使PLC γ的酪氨酸磷酸化，裂解膜磷酯酰肌醇為三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油，IP3增加細胞內游離鈣濃度，進而釋放細胞毒性物質（如穿孔素和顆粒酶）。

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–02–

細胞因子激活NK細胞

細胞因子是維持多種免疫細胞激活和功能性的關鍵成分，通過多種激活性細胞因子或抑制性細胞因子的拮抗劑，能夠刺激并增強患者NK細胞的抗腫瘤作用。

▉?IL-2

IL-2可直接刺激T細胞和NK細胞的增殖和活化。最初發現用IL-2刺激人外周血單核細胞會擴增細胞毒性細胞，命名為淋巴細胞活化殺傷細胞（LAK）。隨后的研究發現，LAK細胞對腫瘤的破壞主要由NK細胞介導。后續研究發現，IL-2可誘導抑制性調節性T細胞（Treg）的產生，其限制了IL-2激活NK細胞的應用。

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▉?IL-15

IL-15是IL-2最有前途的替代品。重要的是，IL-15刺激NK和CD8+T細胞，但不刺激Treg細胞。體外研究表明，IL-15可以增強被TME（腫瘤微環境）耗盡的NK細胞的功能。在缺氧條件下，用IL-15治療功能失調的腫瘤來源的NK細胞，可以恢復線粒體的完整性，增加顆粒酶B的表達，減少細胞凋亡，增強NK細胞毒性和IFNγ的產生[1]。

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▉?IL-12

IL-12主要由抗原呈遞細胞，特別是DC和巨噬細胞產生，刺激CD8+T細胞和NK細胞的募集、效應功能和IFNγ的產生。除了直接激活NK細胞外，IL-12還刺激Th1產生IFNγ和IL-2，從而刺激NK細胞產生更多的IFNγ、穿孔素和顆粒酶B[3]。

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IL-12全身給藥會引起多種不良副作用，在最大耐受劑量下也只能發揮有限的抗癌功效，目前正在開發替代的IL-12遞送方法（如抗體融合的IL-12、IL-12的DNA/RNA的直接遞送、瘤內注射外泌體表達的的IL-12）以期改善IL-12療效。

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▉?IL-18

IL-18是一種促炎細胞因子，由多種細胞產生，包括髓細胞、腸上皮細胞、角質形成細胞和內皮細胞。IL-18（與IL-12聯合）能夠誘導NK細胞表達FASL、增強NK細胞產生IFNγ和TNF的能力、促進NK細胞增殖，并通過誘導CCL21、CCR7的表達促進NK向次級淋巴器官遷移。

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▉?IL-21

IL-21由Th17細胞和DC細胞產生。IL-21通過刺激NK細胞增加穿孔素和顆粒酶B的表達，并上調NKp30和NK細胞受體2B4來增強NK細胞的成熟和增殖，并增強其細胞毒性活性[5]。常IL-2、IL-15、IL-18等細胞因子聯合使用。

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▉?TGF-β抑制劑

TGFβ能夠抑制NK細胞功能，并促進其分化為ILC1，成為毒性大大降低的組織駐型細胞，對腫瘤的殺傷作用大幅度減弱，抑制腫瘤微環境中的TGFβ是恢復NK細胞功能的重要策略。針對TGFβ的藥物大致有三類：中和抗體、配體陷阱、受體激酶抑制劑。

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–03–

免疫檢查點抑制激活NK細胞活性

多少腫瘤的發展與NK細胞功能異常有關。因此，NK細胞功能的恢復可能是抗腫瘤免疫治療的潛在選擇。在T細胞參與的抗腫瘤過程中，免疫檢查點抑制已研究成功。NK細胞同樣也有相同的抗腫瘤機制。

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在NK細胞背景下，嘗試基于T細胞的免疫檢查點抑制劑（例如CTLA-4和PD-1抑制劑）的組合，如抗PD-1和抗PD-L1抑制劑也已顯示增強NK細胞介導的細胞毒性。通過研發更新的免疫檢查點（例如B7-H3，CD200R，CD47和Siglecs7/9），將這些檢查點組合以產生協同的抗腫瘤反應似乎更加合乎邏輯。

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除此之外，還有一些NK特有免疫檢查點：

▉?NKp44

NKp44，其胞質結構域包含一個免疫受體酪氨酸抑制（ITIM）基序，表達PCNA的腫瘤細胞與NK細胞接觸結合時，通過NKp44-PCNA軸傳導抑制信號。

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▉?KIR3DL3

KIR3DL3，可能受免疫抑制性TME誘導而表達上調，通過與配體HHLA2結合傳導抑制信號。KIR，第一個開發用于刺激NK細胞反應的ICI抗體。

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▉?NKG2A

NKG2A，主要存在于實體瘤浸潤性NK細胞中，其配體HLA-E在多種腫瘤中表達被上調。

Front Immunol. 2020 Feb 13;11:167.

如圖，NK細胞中的免疫檢查點抑制作用：

（A）NK細胞表面表達的抑制性受體以藍色棒表示，腫瘤細胞表達受體的配體以橙色棒表示。

（B）矩形框代表通過其進行抑制的受體的細胞內結構域。這些受體中（KIR，ILT2，NKG2A和CD94，TIGIT和CD96，Siglec-7/9，PD-1和SIRPα）在其細胞質尾巴中帶有1-3個ITIM，并觀察到基于ITIM的抑制作用，受體的抗體顯示在紅色方框內。

（C）其他幾種免疫細胞（包括T細胞，B細胞和髓樣細胞）在其表面也表達這些受體，如圖最左側所示，對應每個免疫檢查點受體的表達細胞。

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增強ADCC作用的策略

NK細胞可通過CD16受體介導的ADCC，殺死IgG1或IgG3抗體靶向的細胞。NK細胞表面CD16的不同形態，會影響CD16與抗體Fc端的親和力。

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具體來說，CD16蛋白第158位的氨基酸為苯丙氨酸（158F）時，與Fc的親和力低，而這一位置上的氨基酸為纈氨酸（158V）時，與Fc的親和力高。新一代單克隆抗體療法很多對Fc端進行了修飾，改善了它們與CD16的結合，促進了ADCC的產生。同時，很多抗體在合成時使用了預防抗體Fc端巖藻糖基化的哺乳動物培養系統，增強了它們與CD16的結合。

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▉?雙特異性抗體

雙特異性抗體，可同時與激活NK細胞的受體和腫瘤抗原相結合，促進更有效和持久的NK介導細胞毒性。與單抗不同，這些融合蛋白可以被設計成與多種不同的腫瘤抗原和NK受體相結合，并且可以利用抗體可變區片段（Fv）與CD16結合，保證它們可以與158V C16和158F C16有效結合。類似的蛋白設計已經在雙特異性T細胞銜接器（BiTE）中得到應用。

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目前，Affimed公司開發的AFM13是臨床進展最快的CD16雙特異性抗體之一。這是一款靶向CD30的雙特異性抗體。在治療霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的1期臨床試驗中，它與臍帶血來源的NK細胞聯用，在治療的12名患者中，達到100%的客觀緩解率。

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▉?三特異性抗體

三特異性NK細胞銜接器不但可與腫瘤抗原和CD16受體結合，還可包含IL-15，從而與IL-15受體（位于NK細胞表面）相結合，增強NK細胞的活性。三特異性抗體，由于具有同時與不同NK細胞受體結合的潛力，因此正在成為NK細胞免疫療法的一個令人興奮的前沿。不過，哪些激活性受體組合能夠最大程度增強NK細胞的抗癌活性仍然需要更多研究。

Nat Rev Drug Discov. 2022 Aug;21(8):559-577.?

–05–

過繼性NK細胞療法

NK細胞是研究人員開發新型免疫療法的理想選擇之一。目前，正在開發的NK細胞治療產品主要有兩類：一類是自體或是異體NK細胞治療產品，另一類是CAR-NK產品。

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在增強NK細胞功能方面，在體外培養過程中使用細胞因子進行刺激，常用的細胞因子是IL-2。近年來，IL-12，IL-15， IL-18，IL-21等刺激因子也被用于體外刺激NK細胞，并且能夠誘導成長期生存，具有記憶能力的NK細胞。

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CAR-NK可賦予NK細胞靶向特定腫瘤的能力。CAR-NK細胞的優勢是細胞因子釋放綜合征風險（CRS）更小，神經毒性更小。即使CAR-NK細胞失去了CAR，仍然可通過內在表達的激活性受體識別和殺傷腫瘤細胞。

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除了CAR-NK，研發人員正在探索增強NK細胞功能的其他基因工程策略，包括通過表達趨化因子受體，促進腫瘤浸潤?；贏DCC的療法可以在NK細胞上表達高親和力的138V CD16受體，與激發ADCC的抗體聯用構成組合療法。

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最后，使用CRISPR-Cas9基因編輯系統可以從NK細胞中敲除副調控因子。這些手段為構建更好的NK細胞療法提供了多種可能性。

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文末小結

自然殺傷細胞（NK細胞）具有獨特的抗腫瘤效應，不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。早期臨床數據表明：NK細胞非常適合用于異體治療環境。

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臨床研究表明，NK細胞在治療血液系統惡性腫瘤方面具有安全性和有效性。重要的是，無論采用哪種方法，NK細胞療法都一直顯示出良好的安全性。迄今為止，沒有觀察到CRS或GVHD。然而，大多數報道的成功僅限于血液系統惡性腫瘤，并非所有患者都對NK細胞治療有反應，有些患者最終會復發。

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CAR-NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。相信，基于NK細胞的新型細胞療法可能會引發腫瘤免疫治療的革命性進展。

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參考資料：

[1] Laskowski, T.J., Biederst?dt, A. & Rezvani, K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.Nat Rev Cancer?(2022).?

[2] Maskalenko et al.,?Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders.?Nature Reviews Drug Discovery,??(2022).

[3] Le Saux and Schvartzman?Advanced Materials and Devices for the Regulation and Study of NK Cells.?Int. J. Mol. Sci.,??(2019).

[4] Zhang et al.,. CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside.?Biomarker Research,(2022)

[5]Bald T et al. The NK cell-cancer cycle: advances and new challenges in NK cell-based immunotherapies. Nat Immunol. 2020 Aug;21(8):835-847.

[6]Maskalenko NA et al. Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nat Rev Drug Discov. 2022 Aug;21(8):559-577.

Zhou T et al. IL-18BP is a secreted immune checkpoint and barrier to IL-18 immunotherapy. Nature. 2020 Jul;583(7817):609-614.

[7]Liu S et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. J Hematol Oncol. 2021 Jan 6;14(1):7.

[8]Khan M et al. NK Cell-Based Immune Checkpoint Inhibition. Front Immunol. 2020 Feb 13;11:167.