基于NK細胞受體的CAR-T細胞療法

自然殺傷（natural killer，NK）細胞是一類具有殺傷腫瘤細胞能力的天然免疫細胞，可通過細胞毒性和釋放細胞因子等方式，抵抗病毒或腫瘤細胞的侵襲。作為人體重要的免疫細胞之一，NK細胞在監視腫瘤的過程中發揮至關重要的作用，并以一種與抗原無關的方式表現出對異常細胞的強大殺傷能力。正常情況下，NK細胞處于被抑制狀態，一旦激活性受體被激活，NK細胞從抑制狀態轉變為活化狀態，通過直接裂解、釋放穿孔素方式殺傷腫瘤細胞。NK細胞發生缺陷或受體缺陷將導致腫瘤發生概率增加。

細胞來源于造血干細胞，分布廣泛。NK細胞約占外周血淋巴細胞的10%~15%，由造血干細胞分化而來，具有獨立于T細胞和B細胞之外的發育途徑。NK細胞廣泛分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結等。其中，以外周血和脾、淋巴結中NK細胞活性最高。

細胞可以分為兩個亞群。根據人類NK細胞表達CD56分子的表面密度，可以將NK細胞分為CD56bright和CD56dim兩個亞群。CD56dimNK細胞占外周血NK細胞的90%，為終末分化的NK細胞亞群，以殺傷功能為主，具有很強的細胞毒性。CD56brightNK細胞約占外周血NK細胞的10%，為中間期過渡分化的NK細胞亞群，以分泌細胞因子為主，細胞毒活性較低。

NK細胞主要通過以下機制實現其殺傷功能：

分泌殺傷介質：穿孔素（Perforin）、顆粒酶（Granzyme）、顆粒溶素（Granulysin）等具有細胞毒性的溶解性顆粒，誘導靶細胞凋亡。

釋放可溶性NK細胞毒因子（NKCF）：NKCF與靶細胞表面的NKCF受體結合后，可選擇性殺傷和裂解靶細胞。

通過表達膜TNF家族分子的殺傷效應：NK細胞可以通過膜TNF家族分子（FASL，TRAIL、mTNF等）與靶細胞膜配體結合誘導靶細胞凋亡。

介導ADCC效應：NK細胞表面表達FcγR受體，與靶細胞表面的IgG抗體結合，產生抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）。

分泌細胞因子，發揮免疫調節功能：合成多種小分子蛋白質，比如淋巴因子等，與其他免疫細胞相互作用形成免疫應答。

NK細胞是免疫系統中發揮細胞毒作用最重要的細胞之一，主要依賴于其細胞膜表面的激活性受體和抑制性受體參與天然免疫和適應性免疫。NK細胞發生缺陷或受體缺陷將導致腫瘤發生概率增加。與抗原特異性的經典CAR-T細胞不同，基于NK細胞受體的CAR-T細胞可以識別表達其配體的病毒感染或者突變惡性細胞，具有多靶點和廣譜性的特點，不僅可用于多種血液系統及實體性惡性腫瘤的治療，而且具有不易耐藥的特點，應用前景良好。

CAR-NK又稱為加強版的NK細胞，是通過基因工程手段修飾使其表達CAR，將識別腫瘤細胞表面抗原的抗體（或受體）與激活免疫細胞所需的信號分子連接，可以突破抑制受體的限制而激活NK細胞，以增強NK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷CAR-NK細胞療法流程是：首先抽取患者或健康供者外周血，分離、獲得外周血單個核細胞，然后在體外大量擴增NK細胞；其次通過基因工程修飾，在NK細胞表面表達能夠和腫瘤特定抗原結合的CAR；最后回輸至患者體內，能夠特異性識別帶有特定抗原的腫瘤細胞，引發免疫反應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。CAR-NK細胞療法目前還處于試驗研究階段，在臨床前和臨床試驗中已被證明可以殺死血液和實體腫瘤細胞，顯示了其作為一種具有廣泛臨床應用前景的現成產品的潛力。

根據受體作用，可將NK細胞的受體分為抑制性受體和激活性受體。抑制性受體主要包括CD161、CLＲG1、PD-1、TIM3、LAG3、CD96、TIGIT、NKG2A等，激活性受體主要包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD16等。

NK細胞受體(激活性受體)能夠直接識別病毒感染細胞或者突變的惡性細胞表面的相應配體，從而清除和殺傷這些異常的細胞。基于這個原理，在制備CAR-T細胞時，將編碼CAR胞外段中scFv片段的基因變化成為NKG2D或者NKp30等NK激活性受體的基因，然后再轉染進入T細胞中，就可以制備出基 于NK細胞受體的CAR-T細胞，用于腫瘤的細胞免 疫治療。與抗原特異性的經典CAR-T細胞不同，這種基于NK細胞受體的CAR-T細胞可以識別表達其配體的病毒感染或者突變惡性細胞，具有多靶點和廣譜性的特點，不僅可以用于多種血液系統及實體性惡性腫瘤的治療，而且具有不易耐藥的特點，具有非常良好的應用前景。

CAR-NK細胞療法雖然具有巨大的潛力，但要擴大其臨床應用，仍有一些根本性的問題需要解決。首先，目前的CAR是為構建CAR-T細胞而設計的，因此不是應用于ＮＫ細胞的最佳選擇。CAR結合表位的位置及其與CAR-NK細胞表面的距離影響其結合抗原和激活CAR-NK細胞的能力。其次，外周血NK細胞的使用受到限制，因為原代NK細胞通常很難進行基因修飾；因此，即使使用病毒載體，轉導效率也非常低，而且在過繼轉移設置下，同種異體NK細胞只能存活幾周，限制了它們的抗腫瘤效果。再者，NK細胞對凍融過程敏感，解凍后NK 細胞的存活率和細胞毒性顯著降低。體內注射后曾表現出較差的擴增和持久性，成熟的人NK細胞壽命有限，半衰期估計為14天，這限制了它們的臨床效果。最后，異基因NK細胞可能被Ｔ細胞污染，導致移植物抗宿主?。ǎ纾颍幔妫簦觯澹颍螅酰螅瑁铮螅?ｄｉｓｅａｓｅ，GVHD）或淋巴增殖障礙。對于CAR-NK細胞療法在臨床轉化中存在的上述安全問題，還需要大量研究，進一步建立質量監管規范。