HSC和IPSC衍生的CAR-NK細胞作為可靠的基于細胞的治療解決方案

介紹

在過去十年中，免疫療法已成為具有最高藥物增長潛力的領域之一。它為治療惡性腫瘤提供了越來越多的機會，而傳統(tǒng)放療或化療的結果是有限的。在這些免疫療法中，基于細胞的療法特別有吸引力，因為它可以編程各種效應子功能以實現(xiàn)個性化治療，甚至開發(fā)出副作用減少或不存在的自體治療替代方案。基于細胞的免疫療法已經(jīng)見證了從未修飾的免疫細胞或細胞系向表達新功能的細胞的轉變。嵌合抗原受體 (CAR) 的出現(xiàn)對此類發(fā)展起到了重要作用，因為它使免疫細胞與特定的癌細胞表面標記物結合。CAR蛋白由兩個主要部分組成：一是抗原識別部分，主要是單鏈可變片段（scFv），由抗體重鏈可變片段（VH）和輕鏈可變片段（VL）融合而成。其次，內結構域將來自表面的結合信號轉化為信號級聯(lián)反應，最終激活效應細胞對癌細胞的裂解特性。

盡管自然殺傷 (NK) 細胞已被探索作為臨床環(huán)境中的治療替代方案，主要是 NK 細胞系，如 NK92 和同種異體 NK 細胞移植，但它們與 CAR 工程功能的使用直到最近才受到關注。iPS 細胞具有衍生所有成體組織的能力，包括免疫細胞，如 HSC、T 細胞和 NK 細胞。

目前，在臨床前研究環(huán)境中，有多種分化方案可以從iPS細胞中獲得免疫效應細胞。然而，直到最近才實現(xiàn)了用于區(qū)分 T 細胞和 NK 細胞的強大的無異種和定義的協(xié)議。iPS 細胞向效應免疫細胞分化的主要中間階段之一是HSC階段。HSC 負責成人所有血細胞的生成，包括先天性和適應性免疫細胞。HSC 的常規(guī)來源包括成人骨髓和新生兒的臍帶。由于最先進的成人或臍帶 HSC 擴增方案容易耗盡和分化，因此在提供高擴增產(chǎn)量的同時保持多能特性的方案對于 HSC 在免疫治療中的使用至關重要。實現(xiàn)大量 HSC 的替代或補充方法包括使用 iPS 細胞，由于 iPS 細胞培養(yǎng)條件的穩(wěn)健性，iPS 細胞具有很高的可擴展性。

在這篇綜述中，我們介紹了 iPS 細胞或 HSC 母液的使用及其向 NK 細胞的逐步分化如何代表當前基于 CAR 細胞的免疫療法技術背景下最有前途的策略。我們介紹了主要組件和前瞻性技術解決方案的當前挑戰(zhàn)。

治療細胞的來源

傳統(tǒng)的CAR細胞療法依賴于使用自體患者T淋巴細胞來表達工程功能。在考慮用于治療應用的細胞來源時，自體細胞的使用存在各種挑戰(zhàn)。

第一個挑戰(zhàn)是，并非所有患者都能有效地動員數(shù)量適合治療過程的功能細胞，尤其是那些在傳統(tǒng)治療周期后復發(fā)和難治的患者。這種限制對于任何類型的成熟效應細胞都是常見的，包括T和NK細胞。

第二個挑戰(zhàn)是，源自患者的免疫細胞通常伴隨著一定程度的功能障礙、衰老或衰竭，這導致源自它們的產(chǎn)品的功能性降低。

第三個挑戰(zhàn)是，在當前的實踐環(huán)境中使用患者自體細胞是時間密集型的，因此排除了有時間限制的患者；

因此，并非所有人都可以使用它。

例外情況對應于從儲存的骨髓或儲存的臍帶血中獲得的自體或同種異體 HSC。然而，使用自體骨髓存在被癌細胞污染的風險，特別是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中。這種風險在儲存的自體臍帶血組織中不存在，因為病理的發(fā)生在時間上和解剖上都是遙遠的。

HSC 來源于目前正在評估臍帶血或骨髓以制造 CAR-HSC，CAR-HSC 又可以分化為效應細胞，包括 CAR-T 和 CAR-NK 細胞。然而，使用 HSC 細胞源面臨的一個主要挑戰(zhàn)是初級池的擴增能力有限，同時保留了它們的干性特性。產(chǎn)生擴大未分化 HSC 池的新方法是促進 HSC 使用的有前途的途徑。最近的研究追求在確定的培養(yǎng)條件下擴增 HSC。最理想的是，可以在治療需要之前衍生、擴增和儲存 iPS 細胞和HSC 來源，從而允許進行額外的驗證和質量控制步驟。

此外，人類 iPS 細胞和最近的 HSC 可以進行多次基因組編輯迭代，用于患者定制的 CAR 療法，為自體效應細胞提供無與倫比的優(yōu)勢。隨著確定的細胞外基質（如玻連蛋白、3 層粘連蛋白 521, 和層粘連蛋白 511）的出現(xiàn)，人類 iPS 細胞的擴增產(chǎn)量大大提高，這些基質使原本復雜的培養(yǎng)系統(tǒng)轉變?yōu)榕c標準細胞相當?shù)淖詣踊椒ň€培養(yǎng)系統(tǒng)。

此外，使用涂層微載體或中空纖維反應器允許在封閉的自動化培養(yǎng)系統(tǒng)中擴增高達20倍，產(chǎn)量高達7×109個細胞。這種擴展能力促進了 HSC 和 NK 分化協(xié)議的啟動。據(jù)報道，從iPS細胞分化HSC的效率高達 19% CD45和CD34雙陽性造血祖細胞。同樣，據(jù)報道，NK分化在特定培養(yǎng)條件下的效率高達72%。1同時，傳統(tǒng)的擴增方法據(jù)報道，原代 HSC 最高可增加899倍，而據(jù)報道臍血HSC衍生的NK細胞的分化純度可達到90%。

治療性免疫細胞

另一方面，在考慮效應治療細胞的身份時，目前有兩種主要選擇：T 細胞或 NK 細胞。與 CAR-T 細胞相關的一些缺點包括細胞因子釋放綜合征 (CRS)、免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征 (ICANS)、 以及器官毒性負擔。自體 T 細胞的組成通過白細胞去除術獲得的淋巴細胞因患者而異，從患者到健康個體差異很大。這導致 CAR-T 制造的起始材料不均一，因為 T 細胞未被選擇以獲得有利的CD8 和CD4陽性細胞比例，似乎在 CAR-T 細胞的治療結果中具有重要作用。

使用預存自體或超供體同種異體 iPS 細胞衍生的 T 細胞可以解決異質性問題，因為CD8和 CD4 陽性細胞的比例可以在制造過程中進行調整。此外，T細胞受體 (TCR) 和MHC 匹配的超級供體集合作為分化的起始材料，能夠制造一組可以覆蓋大部分人群并提供免疫相容性的主池。在iPS細胞分化為任何免疫細胞之前，對它們進行工程化 CAR，包括T和NK細胞，然后將避免收集和遺傳修飾異質自體患者細胞的需要，這可能具有潛在的基因組完整性問題。這為T細胞和NK細胞選項提供了實現(xiàn)更高免疫兼容性的途徑。iPS細胞向T細胞的體外分化對模擬重組 TCR 的陽性和陰性選擇提出了挑戰(zhàn)。這方面已通過使用具有特征性重組 TCR 基因的 T 細胞衍生 iPS 細胞得到解決。同樣，在 TCR 基因座上引入轉基因，如 CAR，可使細胞進入TCR 敲除并消除潛在的 TCR 介導的免疫不相容性。在原代 T 細胞上外源表達的CAR 存在通過 TCR 和 CAR 進行并行信號傳遞的缺點，這可能會放大自身免疫性 T 細胞庫。使用帶有 TCR 的同種異體 T 細胞淋巴細胞確實存在 GVHD 的缺點，因為不相容性，包括 HLA、主要組織相容性復合體區(qū)域、同種異體識別的次要組織相容性目標以及影響免疫反應的整體遺傳變異。另一方面，供體 NK 細胞表達缺乏或有限的GVHD誘導。

值得注意的是，最近的研究表明 NK 細胞和CAR-NK細胞不會誘導 CRS、ICANS 或 GVHD。此類研究可以在尚未達到的最大耐受劑量下進行，具有最高測試水平高達每公斤1×107個細胞。理想的治療性 CAR 表達身份可能是 NK 細胞的身份，該身份可能來自 iPS 細胞或來自合適的HSC來源。這是因為從iPS細胞和HSC向NK細胞的分化方案已經(jīng)相當成熟，實現(xiàn)了可重復的定義狀態(tài)。?

如上所述，iPS 細胞和最近的HSC在保持其各自身份的同時呈現(xiàn)出有希望的細胞群可擴展性.此外，這種NK細胞來源不受患者與患者之間的差異、細胞衰竭或衰老的影響，并且不受與患者相關的病毒和癌細胞的污染。最后，這些細胞源可以接受各種制造質量控制層，與現(xiàn)成的生產(chǎn)兼容，并適用于超級供體庫。在表 1 中，我們比較了 T 細胞和NK細胞宿主CAR療法之間的主要對比領域。

表 1. CAR-T 和 CAR-NK 療法的來源和效應子身份的比較

工程功能的集成方法

攜帶 CAR 的治療細胞需要 CAR 基因的持續(xù)和持久表達才能發(fā)揮治療功能。迄今為止，在 CAR 臨床實踐中最廣泛使用的基因整合方法包括逆轉錄病毒，例如慢病毒。此類系統(tǒng)的使用依賴于明確定義的病毒包裝方法。病毒整合系統(tǒng)已被表征，現(xiàn)在已知整合在常染色質區(qū)域隨機發(fā)生，并確定了某些熱點。迄今為止，尚未解決這種隨機整合如何影響患者的臨床結果。眾所周知，這種系統(tǒng)攜帶的轉基因可以整合到癌基因和腫瘤抑制基因中。這是其主要限制之一，因為基因工程過程中的轉化風險無法避免。此外，病毒系統(tǒng)無法充分預定義制造細胞的每個細胞整合 CAR 的拷貝數(shù)。這導致在轉基因細胞產(chǎn)量（群體中的高斯基因密度）與受控遺傳劑量（群體中的泊松基因密度）之間進行選擇。此外，已知慢病毒系統(tǒng)會受到染色質依賴性沉默，其中轉基因的表達水平會隨著時間的推移而下降。這種沉默過程可以影響逆轉并介導復發(fā)。鑒于病毒系統(tǒng)的局限性，由設計者核酸酶介導的基因座特異性轉基因整合為制造具有明確CAR拷貝數(shù)的效應細胞和一致且穩(wěn)定的基因水平表達提供了廣闊的前景。該斷言確定了兩個關鍵的制造組件：首先，要使用的設計者核酸酶，其次，用于整合的基因組位點。

核酸酶

在過去十年中，出現(xiàn)了各種精確的基因組工程工具，包括鋅指核酸酶、TALE 核酸酶和CRISPR核酸酶。關于核酸酶，三個因素控制選擇：制造核酸酶的簡單性、轉基因整合或敲除的目標效率以及避免脫靶的可靠性。關于核酸酶制造的簡單性，鋅指和TALE核酸酶的合成都很麻煩。另一方面，CRISPR核酸酶在技術上易于編程，因為它們只需要一個寡核苷酸成分即可與目標DNA特異性結合。關于在目標特異性和脫靶預防方面，三種類型的核酸酶表現(xiàn)出相似的性能。事實上，他們可以在不引入脫靶突變的情況下專門設計一個品系。

總的來說，由于其快速性，首選使用CRISPR核酸酶來初步定位合適的整合位點和驗證實驗，而使用鋅指和TALE核酸酶更適用于經(jīng)過驗證的基因座和已知的整合性能。

積分位點

如上所述，轉基因的隨機整合可導致基因沉默和必需基因的破壞。安全港基因座是具有允許的表觀遺傳特征的基因組區(qū)域，允許跨譜系或特定細胞類型內的穩(wěn)定轉基因表達。經(jīng)典的安全港基因座包括 CCR5 基因座、腺相關病毒位點 1 (AAVS1) 基因座和小鼠 ROSA26 基因座的人類直向同源物。

最近的研究表明，來自AAVS1安全港基因座的CAR蛋白持續(xù)表達。正如臨床前研究應用所預期的那樣，AAVS1允許CAR在T細胞上持續(xù)表達。或者，已知處于常染色體狀態(tài)的譜系特異性基因座代表了全譜系安全港基因座的強大替代方案。T細胞中的TCR基因就是一個這樣的例子。DNAse敏感性軌跡的映射以及基因體激活的表觀遺傳標記，如H3K甲基化，免疫細胞中的免疫細胞將進一步解鎖安全基因座，以持續(xù)表達治療基因，如CAR。

在這方面，具有充分表征的精確基因工程工具和方法的iPS細胞和 HSC 已成為具有更大潛力的CAR療法的合適細胞來源。上述基本原理支持安全港基因座的精確基因組工程方法，作為整合CAR基因的有前途的方法。在iPS細胞和HSC中設計這樣的基因座，允許穩(wěn)健的基因操作，結合細胞類型特異性向 NK 細胞分化，將為現(xiàn)成的治療開發(fā)提供極具吸引力的替代方案。

使用的CAR結構

可以通過調節(jié) CAR 蛋白的結構來制造更有效、更安全的基于 CAR 細胞的療法。了解 CAR 功能域的修飾如何影響下游信號通路、轉錄輸出和細胞特性，對于開發(fā)下一代基于細胞的療法至關重要。

CAR 蛋白模塊可分為兩個主要部分：第一，介導信號轉導的內域，第二，抗原接合組件或結合介導的轉導組件。

內域

隨著大量CAR蛋白類型的出現(xiàn)，人們注意到雖然一些CAR呈現(xiàn)依賴于結合的信號級聯(lián)激活，但其他的則具有組成型活性。例如，基于 CD28的CAR蛋白導致與LCK的組成型關聯(lián)和CAR CD3ζ結構域的組成型磷酸化。這種組成型激活與 T 細胞耗竭和臨床表現(xiàn)降低有關。這種組成型活性 CAR 蛋白的影響已在效應免疫細胞中表現(xiàn)出來；然而，在分化之前對祖細胞（如 HSC 或 iPS 細胞）的影響仍有待發(fā)現(xiàn)。可以推測，這些途徑可能會引導或阻礙分化過程本身，調節(jié)分化產(chǎn)量和最終細胞身份。一些研究支持這一觀點，因為包含 CD28 結構域的 CAR 有利于 T 細胞向效應類型分化，而 4-1BB 結構域有利于記憶 T 細胞身份，當已經(jīng)在 T 細胞類型譜系中時。這可能導致顯著不同的臨床反應。因此，在iPS細胞或HSC祖細胞被設計用于表達CAR蛋白的環(huán)境中，CAR應該以其下游途徑的明確抗原誘導開啟狀態(tài)來計算。仍有待確定這些內域組合中的哪些提供了適當?shù)拈_關轉換。或者，在存在泄漏關閉狀態(tài)的情況下，這些內域中的哪些與iPS細胞或HSC祖細胞及其分化中間體中存在的轉錄網(wǎng)絡兼容。最終，一個重要的臨床前目標是確定可最大限度提高 HSC 和 iPS 衍生 NK 細胞治療活性的內域組合。

?抗原接合成分

一些研究表明 CAR 的 scFv 組分的結合親和力在減少副作用方面起著重要作用，并且具有低結合親和力的CAR在臨床上是有益的。這種優(yōu)勢似乎僅在效應細胞身份水平和臨床使用期間有益.然而，當使用超級供體祖細胞作為iPS細胞或HSC時，scFv的親和力可能不會影響制造效率。

涉及NK細胞的臨床試驗

迄今為止，已有超過1340項涉及NK細胞療法的臨床試驗。絕大多數(shù)這些試驗都集中在血液系統(tǒng)惡性腫瘤上，這是因為治療性NK細胞更容易接近致瘤細胞（表 2）。幸運的是，越來越多的CAR-NK細胞臨床試驗針對實體惡性腫瘤，如胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。大多數(shù)臨床試驗使用同種異體 NK 細胞，主要來自健康供體和NK細胞系，如NK92。然而，有一小部分臨床試驗評估源自CD34陽性臍帶血細胞的NK細胞（表 2）。后一種方法特別有趣，因為它與現(xiàn)成的解決方案兼容，包括超級捐贈者骨髓庫和超級捐贈者iPS衍生的HSC。盡管有涵蓋細胞因子誘導的記憶樣 (CIML) NK細胞的臨床試驗，但它們與CAR結合的結果仍有待評估。CIML NK細胞最近被描述為循環(huán)血液的組成成分，并且HSC以及iPS細胞向 CIML NK 細胞的分化提供了潛在的協(xié)同作用。有希望的是，有一些利用iPS細胞作為NK細胞來源的臨床試驗，其中一些也表達CAR（表 2）。

表 2. 涉及原代NK細胞、NK細胞系、HSC和iPS細胞衍生的NK細胞和CAR-NK細胞的臨床試驗

結論

在這里，我們展示了細胞來源對于開發(fā)下一代細胞免疫療法的重要性，以及不受變異性和風險因素影響的細胞來源如何推動更安全的治療替代方案的開發(fā)。我們支持iPS細胞和HSC是用于生產(chǎn)現(xiàn)成NK細胞的更安全的細胞來源。我們還總結了關于NK細胞作為基于CAR療法的載體的優(yōu)勢的累積證據(jù)。我們展示了CAR結構域在HSC或iPS細胞來源分化中的潛在作用，以及 CAR 基因在確定的遺傳劑量下整合到精確基因組位點中如何有助于規(guī)避與病毒整合方法相關的缺點。

10.1002/sctm.20-0459