CAR-T細胞治療的挑戰

化療、放療和外科手術是最傳統的癌癥治療方法，但它們的療效較低，副作用嚴重。因此，在過去的十年中，研究人員已經開發了新的策略，從而實現疾病的完全緩解。目前，免疫療法已經成為革命性的癌癥治療方法，有幾種類型的免疫療法用于治療癌癥，其中包括過繼細胞療法（ACT）。

嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法是一種ACT，自體T細胞通過基因工程表達CAR以特異性殺死腫瘤細胞。CAR-T細胞療法是治療對其他一線癌癥治療無反應患者的一個機會，并且已經在血液惡性腫瘤的治療中展現出優越的抗腫瘤效果。然而，這類療法作為一線臨床治療仍有許多挑戰需要克服。從藥學的角度來看，這項新興技術仍然被歸類為先進療法，因此，要應用這項技術，必須首先滿足醫藥監管的某些要求。因此，有必要分析CAR-T細胞技術的要素和挑戰，并將基礎、臨床和實踐等方面的因素考慮在內，采取應對策略，從而使CAR-T技術能夠成為可負擔的治療模式。

回顧CAR-T的發展史，首先要提到1957年Thomas及其同事報告的首次白血病患者骨髓移植以及隨后Miller等人發現了T細胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg報告了一項關于腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的研究，這才讓人們將目光鎖定在“患者自身的免疫細胞可以對抗自身癌癥”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆轉錄病毒介導的基因轉移到T淋巴細胞的方法，使基因修飾成為在實驗或治療環境中控制免疫的手段。幾乎與此同時，ZeligEshhar及其同事利用抗體結合域和T細胞受體上免疫球蛋白的γ或ζ亞單位，通過嵌合單鏈設計了細胞毒性淋巴細胞的特異性激活，從而開發出第一代CAR-T細胞。

五年后，Sadelain博士的研究小組證明，將CD28等共刺激信號整合到CAR-T中可增強生存、增殖并保持活性，從而開發出第二代CAR。隨后，攜帶靶向CD19的CAR-T細胞被開發出來，并啟動了慢性淋巴細胞白血病（CLL）和急性淋巴細胞白血病（ALL）的I期臨床試驗。試驗結果證明CAR-T療法在化療難治性ALL的成人中誘導有效緩解，隨后生物工藝生產規模擴大。

2017年，FDA批準了CD19 CAR-T細胞療法（Tisagenlecleucel）適用于兒童和年輕人的ALL。到目前為止，FDA批準了六種用于癌癥治療的CAR-T細胞治療藥物。

CAR-T細胞治療面臨的挑戰，主要與副作用、毒性、T細胞耗竭和惡性腫瘤微環境（TME）有關。此外，在大規模生產中的制造過程目前既耗時又昂貴，因此，使盡可能多的患者接受CAR-T細胞免疫治療成為一個更大的挑戰。

副作用和毒性

在CAR-T細胞輸注后，這種免疫療法可能具有潛在的致命毒性。據報道，一些副作用包括發熱、炎癥、肝酶異常升高、呼吸困難、發冷、思維混亂、頭暈、嚴重惡心、嘔吐和腹瀉。所有患者均有長期B細胞再生障礙，可通過服用丙種球蛋白緩解。毒性主要有兩類：細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性（NTX）或CAR-T細胞相關腦病綜合征（CRES）。

CRS或“細胞因子風暴”是一種全身炎癥反應，由大量活化淋巴細胞（B細胞、T細胞和自然殺傷細胞）以及髓系細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞和單核細胞）引起廣泛的臨床癥狀，包括發熱、疲勞、頭痛、皮疹、關節痛和肌痛。CRS是第一次輸注CAR-T細胞后幾天內發生的最常見的不良反應（85%的患者出現任何級別的CRS）。嚴重CRS病例以心動過速、低血壓、肺水腫、心功能不全、高熱、缺氧、腎損害、肝衰竭、凝血障礙和不可逆器官損害為特征。幸運的是，CRS的作用可以通過減少輸注T細胞的數量和/或通過服用抗IL-6受體單克隆抗體和類固醇來緩解。

NTX是CAR-T細胞免疫治療的另一常見并發癥，發生在40%以上的患者中。通常出現在CAR-T細胞輸注后的1至3周內，通常與CRS相關。患者表現出各種癥狀，如困惑、遲鈍、震顫、譫妄、找詞困難和頭痛；其他癥狀，如失語癥、顱神經異常和癲癇也有報道。

及時管理毒性對于降低與免疫治療相關的死亡率至關重要，因此，研究人員制定了不同的安全策略來克服和預防CAR-T細胞毒性，如設計新一代的CAR。毒性管理已成為CAR-T細胞免疫治療成功的關鍵步驟。

CAR-T細胞耗竭

盡管CAR-T細胞治療完全緩解率高，然而大部分獲得緩解的患者在幾年內表現出疾病復發，B-ALL的復發率從21%到45%不等，并隨著隨訪時間的延長而增加。治療失敗的部分原因是實體瘤產生的TME導致的CAR-T細胞耗竭。

CAR-T細胞耗竭是指一種功能障礙狀態，其特征是由于持續的抗原刺激、CAR結構的共刺激域和抑制性受體的表達增加而導致抗原特異性T細胞的缺失。體外CAR-T細胞研究表明，在CAR-T細胞耗竭過程中，抑制性受體（如PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表達上調，以及通過CTLA-4抑制PI3K/AKT通路，是導致抗腫瘤功能喪失的主要原因。細胞因子在其中也起著重要作用，如耗竭的CAR-T細胞降低表達分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力此外。其他因素，如轉錄因子、代謝和表觀遺傳修飾，也在CAR-T細胞耗竭發展中發揮重要作用。

延遲耗竭的一種可能方法是構建抗耗竭的CAR-T細胞。最近的報告表明，某些轉錄因子如TOX和NR4A的發現，以及AP-1家族轉錄因子c-Jun的缺失或過度表達增加了CAR-T細胞對耗竭的抵抗力。最近，通過CAR-T細胞工程化（CRISPR/Cas9）敲除PD-1、或使用PD-1阻斷抗體已被用于提高CAR-T治療效果，避免耗竭。

腫瘤微環境

CAR T細胞免疫治療在實體瘤中尚未取得成功。一個可能的原因是TME的免疫抑制性質影響過繼免疫治療的療效。實體瘤存在高度浸潤間質細胞，如癌相關成纖維細胞（CAF）和抑制性免疫細胞，包括髓源性抑制細胞（MDSCs）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、腫瘤相關中性粒細胞（TAN）、肥大細胞，和調節性T細胞（Treg），它們有助于建立一種免疫抑制性TME，能夠干擾CAR-T細胞療法的療效。

克服TME效應的策略包括使T細胞能夠抵抗TME中的腫瘤抑制，例如顯性負性受體或信號轉換器的轉基因表達，其可以將抑制信號轉化為刺激信號。克服CAR-T細胞持續存在和耗竭的另一個機會是改善藥物向腫瘤部位的轉運。對于CAR-T細胞，局部注射是正在進行的一種嘗試。

基因改變

一些報告顯示使用CAR-T細胞治療的患者缺乏療效和復發存在基因改變。Orlando等人整合了全外顯子組DNA-seq和RNA-seq，以研究CD19突變導致復發的程度。他們在12例患者樣本中均發現了CD19基因第2–5外顯子的新發基因改變，9例患者中的8例出現雜合性缺失，結論是CD19純合子突變是獲得性抗CAR-T細胞治療的主要原因。

Asnani等人報告了類似的發現，他們描述了CAR-T細胞治療后復發白血病患者外顯子2和外顯子5-6的跳躍。外顯子2對CAR-T CD19表位的完整性至關重要，而外顯子5-6負責CD19跨膜結構域。然而，需要進一步的研究來探索基因組分析的影響。

制造CAR-T細胞的傳統技術包括：1）通過單采分離患者的T細胞（自體）；2）將回收的細胞運送到一個中心生產基地；3）對其進行基因改造以表達CAR；4）在實驗室中進行擴增；5）將CAR-T細胞送回醫院，注入患者體內。

這種使用自體CAR-T細胞的傳統制造和治療所涉及的物流增加了臨床醫生和患者的復雜性，如今，這種療法帶來了一些些主要的制造業挑戰，其中包括：

CAR-T細胞的包裝、運輸和儲存

CAR-T細胞的臨床制造目前是一個復雜的過程，涉及多個步驟，跨越不同的地理位置，采用多種技術和物流。任何時間、運輸方法、冷鏈或儲存方面的錯誤都會導致細胞損傷，直接影響治療效率，因此每一個步驟都需要仔細管理、精確的樣本跟蹤和足夠的保存技術來冷凍患者樣本。在整個CAR-T細胞制造過程中，需要不同溫度的不同運輸，因此，在生產過程中進行的低溫保存必須保證質量控制。

良好制造規范（GMP）

CAR-T細胞是一項復雜的制備過程，cGMP是CAR-T細胞生產的關鍵和瓶頸。cGMP的目的是提供一個框架，確保訓練有素和定期培訓的員工在良好控制的設施和設備中進行高質量生產。同樣，它提供了涵蓋所有運營方面的嚴格文件流程，以證明持續和充分的合規性。

根據國際標準化組織（ISO）， CAR-T細胞制造需要GMP設施作為細胞處理潔凈室，必須配備1）設施系統（如空氣處理器、24/7報警監控系統）；2）環境監測設備（如粒子計數器）；3） 制造工藝設備（如細胞清洗機、生物反應器）；4）分析設備（如自動細胞計數器、流式細胞儀）。

維持符合GMP要求的生產環境的另一個關鍵因素是高技能員工，他們對GMP生產、質量控制和質量保證應具備廣泛的知識。

慢病毒載體（LV）的制備

LVs的生產面臨諸多挑戰，例如其固有的細胞毒性、低穩定性以及對瞬時轉染影響的依賴性，此外，上游和下游過程的產量低且成本高效益低。這部分已成功的商業化產品部分是建立了標準化和穩定的細胞系，以產生促進GMP合規過程的LVs，從而可以提供更容易的放大、再現性、生物安全性和成本效益。

工作人員和培訓

考慮到治療的復雜性及其相關的高風險副作用，CAR-T細胞的使用受到高度管制，只能在認證中心使用，并由訓練有素的工作人員管理。所有參與CAR-T細胞制造的員工（從T細胞收集到制造商，再到臨床單位）都需要經過廣泛的培訓，具備令人滿意的能力水平。這種能力能夠管理過程中可能出現的復雜情況，從而能夠交付產品。

如今，在這個領域只有少數具備資格的專業人員，需要多學科協作和交流來創造這一領域的更多知識，學術參與也是一個重要方面。

質量控制

作為一種活的“藥物”，CAR-T細胞具有復雜的制備過程，需要“全過程質量控制”。在生產過程中，良好控制的冷鏈運輸和儲存在確保細胞產品質量和防止細菌和支原體污染方面發揮著重要作用。CAR-T細胞質量控制的要求包括檢查體外轉導的T細胞是否存在病毒復制和生產材料殘留。

此外，考慮到CAR-T細胞作為生物產品、細胞產品和基因治療產品的特性，還應包括成品的放行試驗，以確認其特性、純度、安全性和效力。

此外，還需要進行穩定性研究，以驗證儲存條件及其保質期。CAR-T細胞的產生需要更深入的研究，以評估復發和回輸患者的T細胞質量。這些研究應提供有關淋巴細胞群分布的數據。總之，質量控制對于CAR-T治療的成功至關重要。

生產放大

CAR-T細胞的制造應具有可擴展性（即，為每位患者配備多個單一生物反應器），以便在不犧牲產品質量和可重復性的情況下，擴大惠及患者的范圍。個性化治療（如自體細胞治療）不像普通生物制藥那樣只是增加體積，而是需要更精細的放大，即擁有多個生物反應器來放大每個患者的CAR-T細胞。此外，這取決于平行實現多個獨立產品的能力。

制造時間和重復給藥

CAR-T細胞的制造可能需要長達4周的時間，在這段時間內，患者極易遭受疾病進展和死亡的風險。此外，CAR-T細胞制造不允許體積放大，因此，細胞必須作為單個批次制備，限制了可用產品的數量。在這種情況下，患者可能沒有機會快速、方便地接受新的CAR-T細胞輸注。?

定價和可及性

定價和患者可及性是在全世界普及CAR-T細胞使用的最主要限制。目前的CAR-T細胞制造模式高度集中，且每個步驟的過程都很復雜，導致每次治療的費用高達37.3萬美元至47.5萬美元（與治療相關的醫院費用不計入此類平均費用），患者和醫療系統都負擔不起。

這一令人望而卻步的成本限制了患者獲得治療的機會，尤其在社會經濟不發達的國家無法持續，這進一步限制了CAR-T細胞療法的廣泛應用。在CAR-T細胞療法變得經濟實惠之前，其治療潛力將無法真正得到實現。

法規要求

細胞產品的另一個重要瓶頸是監管。CAR-T細胞在全球范圍內被視為高級治療藥物產品（ATMP），這些產品需要許可證。監管機構與標準療法高度相關，但細胞產品有特殊要求。美國或歐盟監管機構正在努力定義最佳指南，以在全球范圍內協調ATMP臨床制造的要求。與此同時，不發達國家面臨著更大的挑戰，因為CAR-T療法在臨床中的使用受到極大限制，導致當局對監管要求缺乏了解。

新生物標志物的發現

生物標記物對于癌癥臨床治療具有重要意義，它們可以用來確定適合CAR-T治療的患者、預后、治療反應預測和監測疾病進展。CAR-T治療的第一個生物標志物是CD19，一種主要在惡性B細胞上表達的B細胞表面蛋白。

目前，正在根據免疫治療的階段尋找不同的生物標志物，包括確定患者基線狀態的生物標志物、CAR-T細胞功能、CAR-T細胞耗竭、CAR-T細胞毒性的生物標志物以及癌癥預后、反應和復發的生物標志物。基線生物標記物包括細胞因子，如IL-2、IL-5、IL-7、TNF-a等；乳酸脫氫酶（LDH）和CD9細胞已被廣泛應用。對于CAR-T細胞功能，提出了以下生物標記物：CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD25、CD127、CD57和CD137。目前，還沒有成熟的生物標志物可用于評估患者輸注后的CAR-T細胞耗竭。一些間接參數可能有助于實現這一目的，如PD-1、LAG-3、TIM-3等抑制性受體的高水平表達。

盡管CAR-T治療取得了重大進展，但仍有必要繼續探索不同的癌細胞類型特異性生物標記物，以開發更特異的治療方法。

異基因CAR-T細胞

目前，大多數CAR-T細胞免疫治療是使用自體T細胞產生的。這在不同層面上表現出若干不利因素，如生產過程可能耗時長且復雜，導致成本增加，此外，由于使用患者來源的T細胞進行CAR治療，面臨的挑戰包括CAR-T細胞增殖較弱、擴增有限和持續性差。

改善這些問題的一個機會是使用同種異體CAR-T細胞，從而減少自體細胞生產的時間延遲。此外，從異基因健康捐贈者中產生通用的CAR-T細胞更容易獲得，質量更高。這對于需要緊急治療的侵襲性癌癥患者非常重要。該策略將擴大可接受該免疫療法的患者數量，使CAR-T細胞療法成為一種現成的治療方法，成本低廉，易于獲得，并將提高T細胞的質量特性。

通用CAR-T細胞也面臨一些挑戰和問題。例如，供體和受體之間的免疫不匹配，如果受試者的異基因T細胞攻擊健康受體組織，可能導致危及生命的移植物抗宿主病（GVHD），如果受試者的免疫系統識別異基因T細胞并對其作出反應，這些細胞可能會被宿主免疫系統迅速消除。一種可能的解決方案是通過基因敲除或破壞供體上的TCR基因和/或HLA I類基因座來消除GVHD。

與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞提供了更多的優勢，例如在自體環境中降低細胞因子釋放綜合征和神經毒性；通過IPSC的使用可以提供了無限量的“現成”NK細胞，對惡性細胞具有快速反應，而不會引起GVHDs；另一個有利點是激活細胞毒性活性的多種機制（NKG2D、KIR、CD16、NKp30、NKp44、NKp46），仍然保持其靶向實體瘤和耐藥腫瘤微環境的滲透能力。CAR-NK臨床前研究表明，其對血液系統惡性腫瘤靶點（CD19和CD20）以及實體腫瘤靶點有效，證明其具有異基因治療的潛力。

改善CAR-T細胞治療的其他策略

雙靶向或串聯CARs，由兩個單獨的CARs在每個T細胞中的共表達組成，它們識別兩種不同的抗原。一些雙重CAR已進入針對CD19/CD20的血液系統惡性腫瘤和實體瘤的臨床試驗。HER2/MUC1雙特異性CAR在乳腺癌模型的體外試驗中具有良好的效果。雙重CAR是解決抗原異質性和防止復發的一種非常有希望的方法。

此外，合成Notch（synNotch）受體已應用于CAR-T細胞以提高安全性。SynNotch受體識別一種特定的腫瘤抗原，然后釋放轉錄激活域，促進CAR的局部表達。此外，synNotch調節的CAR表達可防止組成性信號傳導和耗竭，使更高比例的T細胞處于幼稚/干細胞記憶狀態。

抑制性嵌合抗原受體（iCAR）包含抑制性受體，如PD-1和CTLA-4，在減弱或終止T細胞反應中起著關鍵作用，因此，它們被認為是一種安全策略，使得T細胞能夠區分靶細胞和非靶細胞。

此外，為了有效治療實體瘤，疫苗、生物材料和溶瘤病毒等創新組合策略是很有前景的，因為它們可以直接增強T細胞的功能，或者招募內源性免疫細胞以及重塑TME。

全自動化制造過程

在世界范圍內，需要CAR-T細胞免疫治療的患者數量迅速增加，行業內已經開發了自動化和封閉式制造平臺，以適應這種情況。這項工作的例子包括Cocoon?（Lonza）和CliniMACSProdigy（Miltenyi Biotec）的自動化平臺，這兩個平臺都允許細胞的復制和快速生產，并且每個步驟都有嚴格的記錄。2020年，Lonza和Sheba醫療中心宣布，首例患者在Sheba醫療中心接受了使用Lonza Cocoon平臺制造的CD19 CAR-T細胞免疫治療。

協作網絡

由于高成本和技術的高要求，目前大多數患者仍無法負擔得起CAR-T細胞治療。為了實現CAR-T細胞的普及，有必要在學術界、工業界和醫院等不同利益相關者之間建立一個協作網絡，以便在應用這一技術的每個國家為這類產品制定充分而有力的立法。

因此，大學應該為未來的專業人士提供知識和創新，以便他們研究新的生物標記物發現、開發穩定的細胞系、開發新的驗證產品質量的分析方法以及了解不同的生產系統。應用GMP、質量控制和自動化流程的行業可以支持建立更標準化、更可靠、質量更高的產品，還可以開發現場生產裝置，降低運輸和儲存成本。醫院必須有足夠的設施來管理這項技術，配備現場生產單位管理方面經過培訓的人員，以及有效治療患者的醫務人員和衛生專業人員。

包括所有這些活動，必須在這一領域制定強有力的具體立法，以保證這類高級治療的質量。此外，監管是這一過程的重要組成部分。如今，關于不同國家監管指南的信息很少，EMA和FDA指南已經為這些技術建立了此類要求的基線，但臨床試驗不同階段的行為和結果將涉及新的考量因素。

藥學的角度來看，CAR-T細胞被視為高級治療產品，其質量必須通過其特性、安全性和有效性來證明。這三個方面中的每一個都面臨了重大挑戰。科學界以及工業界都需要繼續努力，在臨床方面，繼續尋找新的生物標記物，改進CARs的開發，降低CRS和NTX的相關不良反應，以及CAR-T細胞在實體瘤中的應用，以提高該療法的安全性和有效性。

在制造和工藝方面，需要成本更低的生產系統，生產的穩定性以及必要的質量要求，這些都是持續的挑戰。此外，這些過程必須完全符合國際和國內監管部門制定的要求。

最后，需要各方面的專業人員在各個階段的多學科參與。通過學術界、工業界、醫院和政府在國際和地區層面的緊密合作，將有可能使更多的患者更廣泛地受益于這項新型的技術。

參考文獻：

1.Chimeric Antigen Receptor-TCells: A Pharmaceutical Scope. Front Pharmacol. 2021; 12: 720692.