由于?CAR-T?細胞療法在 B 細胞急性淋巴細胞白血病 (B-ALL)、大 B 細胞淋巴瘤 (LBCL)、套細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤或多發性骨髓瘤患者中，都表現出令人印象深刻的有效率和持久性，并已成為復發和/或難治性 B 細胞惡性腫瘤的前線治療手段。此外，CAR-T?細胞已被證明可誘導各種晚期實體腫瘤患者的臨床反應，包括膠質母細胞瘤、胰腺導管腺癌、肉瘤、胃腸道癌和去勢抵抗性前列腺癌。盡管與 B 細胞惡性腫瘤患者相比，CAR-T?細胞在實體腫瘤中的臨床反應性較低且較短暫。然而，CAR-T?細胞治療的臨床成功面臨著一系列挑戰，包括在許多惡性腫瘤中缺乏穩定表達的腫瘤特異性抗原?CAR-T?細胞耗竭,?CAR-T?細胞持久性有限和潛在的危及生命的毒性等。多組學數據，包括基因組學、表觀基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等，可以深入了解各種組織或細胞中生物分子在多個維度上的豐度和/或變異。多維分析策略和整合方法的快速發展促進了多組學數據的使用，以描述廣泛研究領域中不同細胞過程的復雜分子特征，包括?CAR-T?細胞治療。CAR-T 療法本質上是一種活細胞藥物，其能夠積極地感知和響應各種各樣的外在和內在因素。因此，通過批量和單細胞分析，識別有害的表型異質性和制造前自體T細胞的通路調節可能有助于?CAR-T?細胞產品的質量控制，或為 CAR 設計或產品制造提供提高其功能的策略。此外，使用多組學策略來監測功能和/或功能失調的?CAR-T?細胞亞群的時間動態擴張，表征?CAR-T?細胞的轉錄組、表觀基因組和代謝動力學，描述限制?CAR-T?細胞浸潤和抑制?CAR-T?細胞毒性的腫瘤微環境 (TME) 特征，確定關鍵細胞因子的來源和功能，并預測新的靶標。此外，在非惡性組織中的非腫瘤毒性可以促進生物標志物的發現，并提高我們對?CAR-T?細胞治療反應和毒性的機制理解。在這篇綜述中，作者強調了多組學數據在推進改善?CAR-T?細胞治療方面的潛力。本文首先概述了已用于?CAR-T?細胞治療研究的多組學剖析技術。接下來，作者討論了利用多組學數據發現單一和組合 CAR 靶標的策略。進一步地，作者討論了通過多組學分析發現的與增強抗腫瘤反應和/或降低?CAR-T?細胞治療毒性相關的分子特征和其他關鍵因素。利用當前和新興的多維組學分析技術，我們將能夠全面理解?CAR-T?細胞療法的分子生物學，最終使這些治療的臨床效益最大化。?一、多維剖析技術 (Multidimensional profiling technologies)來自基因組學、表觀基因組學、轉錄組學、TCR 庫分析、蛋白質組學、代謝組學和微生物學研究的數據已被用于解決?CAR-T?細胞治療的剩余關鍵挑戰。利用這些多組學數據可以為 TME 中影響?CAR-T?細胞治療結果的腫瘤和非惡性細胞特征、細胞狀態轉變、細胞類型和細胞-細胞相互作用提供新的見解 (圖1和表1)。
▲?圖1 | 多組學數據在 CAR-T 細胞治療中的應用概述
▲?表1 | 應用于研究 CAR-T 細胞治療的代表性多組學分析方法
1.1 基因組學 (Genomics)
通過比較來自腫瘤和非惡性組織樣本的 DNA 測序 (DNA-seq) 數據，人們已經確定了許多與腫瘤相關的體細胞突變。其中一些突變可能產生腫瘤特異性的新抗原，如果這些新抗原呈現在細胞表面，就可能作為 CAR-T 或 TCR-T 的新靶點。然而，迄今為止，用新抗原導向的?CAR-T?細胞靶向癌細胞的嘗試還僅限于少數臨床前和臨床研究。另外，腫瘤相關突變和復雜的基因組改變，可能也會影響?CAR-T?細胞治療的臨床反應。通過全基因組文庫化 CRISPR-Cas9 敲除篩選，隨后通過測序檢測單個 sgRNA 的頻率富集情況，已使我們得以大規模、高通量研究和評估不同條件下單個基因的影響，從而更高效地確定細胞的功能依賴性。這種功能基因組學分析手段已經幫助我們確定了涉及 T 細胞激活、持久性、細胞毒性和功能障礙的關鍵基因，以及影響治療耐藥性的腫瘤細胞的遺傳改變，提供了可能被利用來提高?CAR-T?治療療效的調控因子。同時，基于 CRISPR-Cas9 的功能獲得性篩選結合單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq), 已被用于檢測表達不同敲入結構的 T 細胞的豐度并評估其狀態，該研究發現了一種可用于可提高?CAR-T?細胞對實體瘤清除效能的新型嵌合細胞共刺激受體?？傊?，功能基因組學分析是一種強有力的方法，可以闡明?CAR-T?細胞功能的機制調控，最終可能用于改進 CAR 設計或細胞工程。1.2 表觀基因組學 （Epigenomics）
表觀遺傳因素，包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質可及性和 3D 結構。復雜而多層次的表觀修飾使多個細胞信號的整合能夠動態調節基因表達程序，并最終調節 T 細胞的表型和功能。因此，通過擾動表觀遺傳調節劑對?CAR-T?細胞進行表觀遺傳重編程可能有助于提高 CAR-T 的抗腫瘤效能。全基因組表觀基因組分析技術已成為研究表觀遺傳調控景觀 (包括?CAR-T?細胞) 的最佳方法。例如，DNA 甲基化陣列分析可以幫助識別與?CAR-T?細胞治療反應相關的差異甲基化位點。結合使用 ATAC-seq 和 RNA-seq 的轉座酶可達染色質分析，可以促進識別表觀基因組的調控模塊，而這些模塊控制與?CAR-T?細胞耗竭和細胞毒性相關的細胞程序，從而為潛在的表觀遺傳重編程策略提供了許多見解并有助于發現提高療效的調控通路。單細胞表觀基因組學分析仍在快速發展，目前已經能夠評估單個?CAR-T?細胞內的表觀遺傳調控圖景。將單細胞 ATAC-seq 數據與轉錄組學和蛋白質組學數據相結合，有助于確定與?CAR-T?細胞功能亞群相關的表觀遺傳調控模式?？偟膩碚f，表觀基因組分析研究的新證據證明了?CAR-T?細胞內動態表觀遺傳改變，及其在確定與治療療效相關的分子特征方面的重要性。1.3 轉錄組（Transcriptome）
TCR 是 T 細胞表面的一種異二聚體蛋白復合物，可由異質 TCRα 和 TCRβ 或 TCRγ 和 TCRδ 鏈組成，由單個 T 細胞克隆中不同的 V、D、L 和 C基因片段隨機遺傳重組形成。TCR 形成過程會導致不同的 T 細胞群具有高度多樣化的 TCR 庫，以介導抗原特異性的適應性免疫反應。高通量技術已經可以對每個 T 細胞中表達的 TCR 鏈進行測序，從而表征 TCR 庫和 T 細胞群的克隆多樣性。結合其他組學方法(如轉錄組學分析) 進行 TCR 測序，可以使特定的 TCR 克隆型與不同的 T 細胞表型相關聯。這種聯合分析可以通過追蹤不同亞群間的 T 細胞克隆性來幫助描述 T 細胞動力學，而且這樣的研究已經證明了高度擴增的?CAR-T?細胞克隆型在癌癥患者中的細胞毒性和增殖特性。此外，單細胞技術的進步已經能夠在單個細胞中同時進行 TCR 測序和 scRNA-seq，這將特定的 TCR 克隆型分配給具有不同轉錄表型的單個 T 細胞，因此可以將 TCR 克隆型用作整個治療過程中 T 細胞功能狀態擴張和持久性的替代品。需要注意的是，單個 TCR 克隆型可以包含沿著功能連續體的混合細胞狀態，這些分析方法提供了進一步探索特定的克隆典型定義的T細胞狀態是否與?CAR-T?細胞性能或毒性相關的途徑。
1.5 蛋白質組學 (Proteomics)蛋白質組學分析能夠識別和量化蛋白質及其翻譯后修飾 (如磷酸化和糖基化)，以表征細胞的通路活性和細胞功能。例如，免疫腫瘤學領域新興的蛋白質組學分析方法極大地提高了我們對腫瘤免疫逃避機制的理解。值得注意的是，在癌癥免疫治療的背景下，應用單細胞蛋白質組學分析在 TME 中發現不同免疫細胞表型的臨床相關性方面已經取得了前期的成功。傳統的蛋白質組分析技術，如提供選擇蛋白質表達數據的蛋白質微陣列，已被應用于量化?CAR-T?細胞治療后淋巴瘤或白血病患者的血漿細胞因子水平。而隨著基于質譜的蛋白質組學技術的進步，人們已經實現了膜蛋白質組的高通量分析，包括細胞表面蛋白組和免疫肽組，以及磷蛋白組中反映的信號通路動態變化。腫瘤細胞的表面蛋白組已成為各種血液學和實體性惡性腫瘤治療新靶點的重要來源。非惡性組織的免疫肽組和表面組可以作為腫瘤特異性靶點選擇的參考數據庫，從而避免靶上和腫瘤外毒性。磷酸蛋白組學可用于表征 CAR 下游信號活性，以評估與不同 CAR 結構相關的功能狀態。因此，蛋白質組學分析加深了我們對 CAR-T 細胞治療各個方面的知識，特別是 CAR 靶點的發現和 CAR 功能。流式細胞術是用于免疫細胞分類的單細胞水平的膜蛋白和細胞內蛋白檢測的金標準。全光譜流式細胞術的正在快速進步，其中高靈敏度的檢測器陣列用于捕捉各種熒光分子的全發射光譜，通過增加可在實驗運行中評估的細胞參數數量來提高通量，從而為免疫治療研究中的蛋白質表達分析提供了一種強大的方法。大規模細胞術，或飛行時間細胞術(CyTOF)，結合流式細胞術和質譜技術，實現了高通量、單細胞蛋白質組學分析 (通過在一次運行中同時評估數百萬個細胞中的>40蛋白)，用于實現多維度細胞表型的刻畫。在臨床前和臨床環境中，CAR-T?細胞的蛋白表達的大規模細胞術分析，已被用于功能表征以幫助快速監測 CAR-T 細胞的動態特征。單細胞分泌組分析技術也得到了發展。例如，單細胞微室、蛋白質組學條形碼和多重免疫分析芯片已被用于通過預灌注?CAR-T?細胞產品量化約 32種選定效應物和免疫刺激分子的分泌，以衡量其“多功能性”，這些因子與臨床反應和毒性相關。?1.5 代謝組學（Metabolomics）代謝組學分析對代謝過程中產生的一組小分子進行表征，提供各種細胞代謝活動的功能解讀。T 細胞的功能受內在和外在代謝因子的調節，而強大的內在代謝活性對于有效的 T 細胞毒性是必要的。例如，由于缺氧和/或營養可用性降低，TME 中的代謝中斷可導致浸潤的 T 細胞的代謝需求得不到滿足，從而限制其抗腫瘤活性。因此，維持?CAR-T?細胞的代謝適應度對于提高其治療效果非常重要，特別是增強其在實體瘤免疫抑制 TME 中的功能。以質譜為基礎的代謝組學能夠同時進行靶向代謝物定量和全面的非靶向代謝物分析。一些研究已經描述了 T 細胞中通過各種生化過程產生的代謝物及其中間產物。糖酵解和三羧酸循環代謝產物的靶向量化強調了影響腫瘤浸潤 T 細胞增殖和衰竭的固有代謝過程受損，提供了通過代謝重編程增強?CAR-T?細胞功效的機會。代謝組學數據還可以用于?CAR-T?細胞的代謝重編程，以增強它們的適應性和對不利的外部、微環境因素的抵抗力。細胞代謝是可變的，能適應環境的限制。通量組學描述了參與細胞內代謝網絡的代謝物的產生和消耗速率，這反映了細胞內的動態代謝過程。穩定同位素和質譜的組合可用于跟蹤和量化動態代謝通量，稱為代謝通量分析，從而能夠對糖酵解和線粒體呼吸等感興趣的代謝途徑進行通量組學分析。這種方法對于不同 CAR 設計或不同環境條件下?CAR-T?細胞代謝過程的動態評估具有優勢，新興的通量組學數據表明，維持?CAR-T?細胞代謝適應度對有效治療的關鍵作用。1.6 微生物組（Microbiomics）
微生物群正在成為調節癌癥進展和治療反應的關鍵因素。一些研究已經證明了腸道微生物組或飲食干預與免疫療法的臨床反應之間的相關性，特別是針對 CTLA4, PD-1 或 PD-L1 的免疫檢查點抑制劑。此外，通過糞便微生物移植健康供體或應答者的有益菌群進行微生物干預，可以提高免疫檢查點抑制劑的療效。兩種主要方法已開發用于微生物區系的分析：16S 核糖體 RNA-seq (16S rRNA-seq)和宏基因組鳥槍測序。16S rRNA-seq 用于微生物分類組成的大規模分析更具成本效益，但不能提供關于病毒或真核成分的信息。宏基因組鳥槍測序全面覆蓋了樣本中存在的所有微生物，增加了發現在癌癥中具有潛在作用的新物種的潛力，并為分析功能變異提供了基因水平分辨率的數據，盡管這些好處是以計算挑戰為代價的。對接受?CAR-T?細胞治療的患者的糞便樣本進行微生物學分析，揭示了腸道菌群組成與治療反應之間的相關性，這表明有希望利用與菌群的聯系來改善?CAR-T?細胞治療。目前的研究主要集中在腸道微生物群的影響上，然而腫瘤內微生物群也可能對抗腫瘤免疫反應有重要影響，這可能代表著未來需要探索的另一個維度。二、將空間背景信息納入組學分析（Incorporation of spatial contexture into omics profiling）空間分子分析方法的進步，特別是空間轉錄組學和空間蛋白質組學，已經能夠使用組織切片對基因和蛋白質表達的局部變異進行大規模和高分辨率的描述?？臻g轉錄組學是一項新興技術，能夠在近細胞或亞細胞分辨率下實現高維或轉錄組范圍內的 RNA 定量，當與非空間分辨率的單細胞轉錄組學集成時，可以通過在組織結構中精確定位細胞來加強對細胞-細胞相互作用的分析。類似的方法正在開發用于空間表觀基因組分析，如空間 ATAC-seq 和目標和標記下的空間切割 (CUT&Tag-seq)，這已被證明在高分辨率表征組織中的表觀遺傳調控方面具有實用價值。已建立的空間蛋白質組學技術，如成像大規模細胞術，能夠在組織載片上同時定量和定位大約 40 種蛋白質，同時保留組織結構，以解析 TME 的細胞組成，并在亞細胞分辨率探索各種癌癥類型的細胞因子環境。此外，為了探索 TME 中 T 細胞代謝程序的空間組織，一項研究利用 CyTOF 來量化單個細胞中參與代謝調節組的蛋白質的表達，并將 CyTOF 與飛行時間多重離子束成像 (MIBI-TOF) 耦合以表征這些蛋白質在組織中的分布和表達?？臻g通量組學還可用于癌癥研究的動態代謝分析。這些方法尚未應用于?CAR-T?細胞研究，但將空間背景納入組學分析有望增加我們對細胞-細胞相互作用和細胞鄰近如何影響與反應和毒性相關的關鍵細胞程序的理解。2.1 多組學數據處理的挑戰盡管多組學分析在?CAR-T?細胞治療領域有廣泛的應用和顯著的進展，但在數據分析和解釋方面仍然存在顯著的挑戰。首先，使用大塊組織的多組學技術在大規模數據生成中具有廣泛的用途，但在混合細胞群的背景下，信號的潛在掩蔽和信號的平均化可能會降低新靶點發現的潛力和結果的可重復性。這些問題可能可以通過新開發的反卷積算法得到解決，前提是潛在的參考簽名準確地反映了相關微環境中每種細胞類型和病理狀態的轉錄譜。此外，高分辨率單細胞和/或空間多組學分析技術的革命性應用為?CAR-T?細胞治療提供了各種豐富的數據，盡管這些技術帶來了一定程度的計算復雜性，需要開發和優化創新的生物信息學工具。其次，適當調整分析方法以適應新的應用是實現生物解釋穩健和可重復結果的一個具有挑戰性但至關重要的步驟;對于大多數類型的組學數據，需要仔細評估和修正由樣本處理協議和數據生成平臺的差異引起的批量效應。此外，對于單細胞和空間組學數據，數據的稀疏性和背景噪聲是共同的挑戰，需要使用適當的計算算法進行信號檢測。第三，細胞中分子波動的動力學可能需要進一步的組學研究，并采用時間分辨率設計。事實上，一些研究已經證明了在?CAR-T?細胞治療的不同階段監測多組學變化的重要性，以更好地描述與治療相關的生物學變化。最后，隨著多組學數據量的積累，迫切需要優化的計算方法來整合來自多個組學模式的數據。開創性研究已經證明了多組學機器學習模型預測治療反應的能力，這表明人工智能算法有望在未來的研究中進行數據集成;然而，與復雜的分析程序和結果的生物學轉譯有關的挑戰仍有待解決。?三、CAR-T?細胞治療的靶點發現識別具有較高腫瘤特異性和覆蓋率的 CAR 靶點，對于確保抗腫瘤療效和降低?CAR-T?細胞治療的毒性均至關重要。一般來說，理想的 CAR 靶點應該在所有腫瘤細胞的表面特異性地高表達，而不表達在非惡性細胞上。然而，由于腫瘤細胞和非惡性細胞之間共享大量抗原，以及腫瘤細胞之間的高度的異質性，確定合適的?CAR-T?細胞靶點一直具有極高的挑戰性，特別是對于實體腫瘤而言。在這種情況下，利用和整合多維組學數據將是確定最佳的 CAR 靶標的一種極具前景的方法。
▲?圖2：多組學數據在 CAR 靶標識別中的應用
3.1 發現單個 CAR 靶點來自惡性組織和非惡性組織分析的轉錄組學和/或蛋白質組學數據已被廣泛應用于發現腫瘤中過表達的?CAR-T?細胞靶標(圖2)。在一項使用新型 RNA-seq 分析方法的研究中，glypican 2 被確定為在成神經細胞瘤細胞表面選擇性高水平表達的靶標，而在非惡性組織中未被明顯檢測到。對人類蛋白質圖譜和基因型-組織表達 (GTEx) 項目中包含的非惡性組織的數據，以及人類蛋白質圖譜病理數據庫和癌癥差異表達蛋白數據庫中包含的腫瘤樣本的數據進行分析，其中包括 78種不同的組織、124種細胞類型和 20種癌癥類型，揭示了超過 100個候選 CAR 靶點的表達圖景。在另一項研究中，基因組學、轉錄組學和免疫肽組學數據被整合起來，以鑒定來自成神經細胞瘤中高表達的細胞內癌蛋白的 MHC 結合肽。由 PHOX2B 編碼并由 HLA-A*24:02 呈現的非突變肽 (QYNPIRTTF) 被選為產生高度特異性的肽中心 CARs 的主要靶點，其在異種移植模型中誘導腫瘤的完全消退。因此，大量轉錄組學和/或蛋白質組學分析提供了大量和全面的公共資源，支持跨不同組織、細胞和癌癥類型的 CAR 靶點的全基因組篩查。然而，平均來自大塊組織的基因或蛋白質表達數據可能會掩蓋來自罕見細胞群的信號，這對?CAR-T?細胞治療的有效性和毒性具有潛在的重要意義。單細胞技術，如 scRNA-seq，能夠以前所未有的分辨率進行組學分析，以發現 CAR 目標，包括識別潛在的安全信號。例如，對來自人類腦組織樣本的三個獨立的大規模 scRNA-seq 數據集的分析發現了一種罕見的表達 CD19 的壁細胞群體，這可能有助于 CD19 導向的?CAR-T?細胞治療的靶向性、腫瘤外神經毒性。類似地，對兩個廣泛的 scRNA-seq 數據集的分析預測了 591個不同 CAR 靶點在廣泛的組織和細胞類型中的靶向和腫瘤外毒性情況，確定了許多“潛在風險基因” (包括EGFR)。數據庫 CARTSC 也可以作為提供單細胞水平的 CAR 靶表達數據的寶貴資源。新抗原是新型腫瘤特異性蛋白，主要由腫瘤細胞的體細胞突變產生，可能是免疫治療的理想靶點。為了篩選新抗原，通常對配對的腫瘤和非惡性樣本進行比較全外顯子組或全基因組測序，以確定腫瘤特異性的非同義體細胞突變，然后進行 RNA 測序和質譜分析，以確認突變的 mRNA 和多肽的表達。幾種新抗原已經被作為治療血液系統或實體性惡性腫瘤的有前途的 CAR 靶點。例如，EGFR 變體III (EGFRvIII) 是一種在某些實體腫瘤中特異性表達的新抗原，包括膠質母細胞瘤的一個子集，導致正在進行的 EGFRvIII 定向?CAR-T?細胞的臨床試驗 (如NCT03726515, NCT03283631 和 NCT03638206)。迄今為止，高通量多維組學方法已經能夠識別大量的新抗原，為?CAR-T?細胞治療提供了豐富的腫瘤特異性靶點來源。3.2 CAR 組合靶標的鑒定事實證明，使用單一 CAR 靶點充分區分腫瘤細胞和非惡性細胞具有挑戰性，這不僅是因為對靶點和腫瘤外的毒性，而且還因為抗原逃逸導致治療耐藥性。這個問題可以通過使用布爾邏輯門控 “AND”和/或“AND-NOT” 結合多個?CAR-T?靶點來進行克服，以增加腫瘤靶向的特異性并降低潛在毒性 (圖2)。簡而言之，只有當兩個目標抗原同時表達在腫瘤細胞上時，具有 “AND” 邏輯門控的?CAR-T?細胞才能被觸發；而具有 “AND-NOT” 邏輯門控的?CAR-T?細胞只有在存在腫瘤細胞上表達的靶抗原和不存在正常在非惡性細胞上表達的抗原時才能被激活。多組學數據集成已經證明了通過基于表達譜的組合 CAR 靶標的識別來改善?CAR-T?細胞設計的潛力。例如，對來自非惡性和惡性組織的大量轉錄組學和蛋白質組學數據集進行了綜合分析，以提出急性髓系白血病的最佳CAR組合靶點，有四個可能的 “AND” 對滿足嚴格的療效和安全性標準?；趤碜园┌Y基因組圖譜 (TCGA) 中腫瘤和 GTEx 中非惡性組織的 mRNA 表達數據，對編碼表面蛋白的 3567個基因進行了比較轉錄組學分析，確定了對 “AND” 和對 “AND-NOT” 門控 CAR 靶點。其他研究也類似地應用了多組學數據來發現“與”或“與-非”邏輯門 CARs 的雙重目標。這種策略也可以應用于識別更復雜的 CAR 目標組合，如三重靶標。例如，來自 TCGA 的 33種腫瘤類型和來自 GTEx 的 34種非惡性組織的大規模 mRNA 表達數據已用于 2358個預測表面基因的綜合計算篩選，以研究“AND”或“AND-NOT”邏輯門控制的 CARs 的兩個或三個靶抗原的潛在組合。該研究表明，與單一目標相比，組合 CAR 目標具有更好的鑒別能力；所有預測抗原對的性能數據都可通過抗原探索者門戶網站獲得。盡管布爾邏輯門控 CAR 尚未在臨床環境中使用，但其他減輕抗原逃逸可能性的組合抗原靶向策略，例如，在急性髓系白血病中預測 CLL1 和 CD33 的表達，在 B-ALL 和 LBCL 中預測 CD19 和 CD22，在多發性骨髓瘤中預測 BCMA 和 GPRC5D，在臨床前和/或臨床研究中顯示出增強?CAR-T?細胞抗腫瘤活性的希望。單細胞表達數據也為預測?CAR-T?細胞組合靶標的有效性和安全性提供了高分辨率。例如，使用 scRNA-seq 數據的分析已經預測了基于批量表達數據識別的預定義 CAR 靶對列表的潛在毒性風險。理論上，需要充分利用來自腫瘤和非惡性組織的綜合單細胞多組學數據來為?CAR-T?細胞治療指定最佳靶抗原，從而限制毒性風險。一些 scRNA-seq 數據資源提供了包含多個器官和細胞類型的人類非惡性細胞圖譜，以及正在開發的大規模泛癌癥單細胞圖譜(如人類腫瘤圖譜網絡所繪制的圖譜)。然而，單細胞技術也有局限性，包括 scRNA-seq 測量值的很大一部分為零，這可能反映轉錄本缺失或基因表達的真正缺失。目前，發現既高效又安全的最佳?CAR-T?細胞靶點可能最好也是最可行的方法是，首先根據大量組學數據提名在腫瘤細胞中高度和普遍表達的有希望的靶點，然后使用單細胞組學數據預測指定靶點的靶上毒性和腫瘤外毒性的風險。值得注意的是，基于 RNA-seq 數據識別 CAR 靶標并不簡單，需要與人體表面數據整合，并通過蛋白質組學技術(如流式細胞術)驗證靶標表達。此外，靶蛋白在細胞表面的表達并不一定與臨床反應相關，例如，由于腫瘤細胞中抗原的高度異質性表達，因此需要在嚴格的臨床前研究和早期臨床試驗中對具有新靶點的?CAR-T?細胞產品進行仔細評估。四、了解并增強?CAR-T?細胞的功效和持久性（Understanding and enhancing CAR T cell efficacy and persistence）全面了解影響?CAR-T?細胞抗腫瘤療效的生物學因素對于制定策略以實現穩健和持久的治療反應并使臨床獲益最大化至關重要。整合大量和/或單細胞多維組學數據來研究與治療療效相關的關鍵特征的可行性已得到明確證明?CAR-T?細胞療效和持久性的主要決定因素可以分為四大類：T 細胞狀態和表型、腫瘤細胞特征、TME 和微生物群 (圖3和表2)。
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