CAR-T細胞的制造

T細胞工程始于使用 γ-逆轉錄病毒載體，后來擴展到慢病毒載體和 DNA 轉座子，所有這些都介導了穩定的長期轉基因表達。信使RNA轉染也可用于瞬時CAR表達的目的。大多數γ-逆轉錄病毒載體來源于莫洛尼鼠白血病病毒和骨髓增殖性肉瘤病毒，并經過優化以促進高水平的轉基因表達。?

FDA 批準的五種 CAR T細胞產品中的三種，Breyanzi、Tecartus 和 Yescarta，利用γ-逆轉錄病毒載體將 CD19 特異性 CAR 遞送到 T 細胞中。大多數慢病毒載體源自HIV-1，并使用VSV-G 包膜進行假型化。γ-逆轉錄病毒和慢病毒載體均介導高水平和穩定的CAR表達。

迄今為止，融合性 VSV-G 糖蛋白的組成型表達阻礙了穩定包裝細胞系的建立，這是載體生產的重大負擔，但慢病毒載體是有效的。Kymriah 是 FDA 和 EMA 批準的第一個4-1BB CAR，是一種T細胞產品，由瞬時轉染產生的載體制造。

基于 DNA 轉座子的系統，如睡美人，已被開發用于生產用于臨床研究的 CAR T細胞，并最初顯示出適度的功效 。與病毒載體相比，睡美人的局限性包括遺傳轉座效率低，因此，需要通過人工APC 和細胞因子刺激來繁殖CAR T細胞，從而導致體外培養時間延長。

最近，使用靶向核酸酶結合腺相關病毒載體作為CAR轉錄單位的供體 DNA進行位點特異性CAR整合，已經能夠從 T 細胞受體 α 鏈 (TRAC) 位點嚴格調節 CAR 表達。

由基因編輯工具（例如 CRISPR/cas9 和引導 RNA）啟用的位點特異性雙鏈斷裂隨后通過同源定向修復進行修復。

自體CAR T細胞制造始于收集患者或捐贈者的血液或白細胞去除術。CD3+ T細胞用作 CAR T 細胞制造的起始細胞。腫瘤 細胞和單核細胞的去除可以通過CD4 和 CD8 T細胞的陽性選擇來介導。CD4/CD8 T 細胞選擇已被證明可以提高CAR T細胞制造的可行性，并導致與全單采產品相比，炎癥毒性更高，導致患者 I 期臨床試驗中的劑量降低復發/難治性CD22+ 惡性腫瘤。從具有確定特性的 T 細胞群中生成 CAR T 細胞有可能為從一個患者到另一個患者提供更一致的材料來源。

在動物模型中已經表明，與源自TN na?ve 、TCM 中央記憶 或 TSCM 記憶干細胞亞群的 CAR T 細胞相比，CAR T 細胞具有增強的抗腫瘤活性。大量 T 細胞， CD8 TCM 亞群也已被證明在臨床前模型中是活躍的。

源自 CD62L+ TCM 亞群的 CAR T 細胞已用于膠質母細胞瘤患者的臨床環境，并促進了一名患者的腫瘤消退。

具有確定比例的 CD4+CAR+和 CD8+CAR+TCM，或 CD4+CAR+和 CD8+CAR+ 的 CAR T 細胞可能會減輕毒性，并促進 B-ALL 和 NHL 患者在輸注后的無病生存。

T 細胞亞群可能的治療益處需要在長期患者隨訪和更大的患者隊列中進行評估，以確定其益處是否證明制造方案的復雜性增加以及與選擇程序相關的額外成本是合理的。

用 OKT3 抗體激活 T 細胞可以用 CD28 等共刺激分子進行調節。已開發出與抗 CD3 和抗 CD28 抗體偶聯的現成的當前良好生產規范 (cGMP) 珠子，以優化 T 細胞選擇和體外擴增（磁性 DynabeadsTM [116]、T-cell TransActTM 生物可降解納米珠），并廣泛用于在臨床 CAR T 細胞制造的背景下激活T細胞。

或者，人工抗原呈遞細胞 (AAPC)，如 K562 CML 細胞，已被定制并用共刺激分子裝飾，以激活和擴展 T 細胞亞群，如CD8+、抗原特異性和 CD19-CAR-T 細胞。單獨或與愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV) 特異性 LCL結合 OKT3 抗體和 IL2 的輻照自體 PBMC也已分別用于生成 CD19 和 CD20特異性CAR T細胞。盡管如此，由于根據 cGMP 生成 AAPC 的復雜性，AAPC 作為 T 細胞激活劑的臨床應用數量相當有限。

有幾個平臺，例如燒瓶和袋子中的靜態培養、波動混合生物反應器和連續生物反應器中的擴增，可用于制造臨床 CAR T 細胞（Wang 和 Riviere 綜述）。波浪混合生物反應器被學術中心和生物技術公司廣泛用于 CAR T 細胞擴增，以支持早期臨床試驗。

其他集成制造平臺，例如 CliniMACS Prodigy System，是完全封閉的，旨在整合 T 細胞選擇、激活、轉導、擴增和配方，從而實現更高程度的自動化，支持連續細胞培養，并在很大程度上減少人際操作員的變異性.使用 CliniMACS Prodigy 制造的 CD19 CAR T 細胞進行的 I 期臨床試驗產生了令人鼓舞的臨床反應，有可能實現即時制造的概念 。

另一種新推出的集成端到端電池制造解決方案是Cocoon平臺，目前正在以色列 Sheba 醫療中心的臨床試驗中對其進行研究 (NCT02772198)。

提高自體患者來源 T 細胞的抗腫瘤功效的需要促使開發新的培養試劑、技術和制造平臺。特別是，在動物模型和人類受試者中，培養時間少于24小時的最低限度操作的CAR T細胞已證明具有一定水平的抗腫瘤活性。這種方法的優化可以簡化CAR-T制造，并有可能大幅降低總成本。

雖然自體CAR T細胞療法需要針對每位患者的白細胞去除術進行定制的制造工藝，但現成的和同種異體CAR療法提供了避免患者 T 細胞的可變質量和損傷的前景，減少了產量的可變性并使表型均勻化注入的CAR T細胞。一旦開出CAR T細胞，同種異體CAR T細胞也將縮短 T 細胞輸注的延遲。

然而，同種異體方法面臨兩個主要挑戰。第一個是引起移植物抗宿主病 (GVHD) 的風險，第二個是宿主免疫系統快速消除同種異體細胞，限制了它們的抗腫瘤活性。有幾種解決方案可以解決第一個挑戰，使用來自干細胞移植供體的同種異體CAR T細胞、病毒特異性記憶 T 細胞、非 αβ T細胞和/或基因編輯來消除TCR表達。第二個挑戰，避免快速消除，更復雜，仍在等待有效的解決方案。

從誘導多能干細胞 (iPSC) 產生免疫細胞提供了一個替代平臺來生產“現成的”和合成的同種異體 T 細胞。原理驗證研究支持這種方法的可行性。iPS 衍生的NK細胞已經進入臨床 (NCT03841110)，iPS衍生的T細胞將很快在復發/難治性 B 細胞淋巴瘤患者中進行研究 (NCT04629729)。

CAR T細胞有可能在體內進行改造，完全通過體外制造。這項技術處于發展的早期階段，其潛力仍然未知。使用 γ-逆轉錄病毒載體、腺病毒載體和脂質納米顆粒的早期研究表明在體內轉導 T 細胞的可行性。

文獻來自文獻Eur.J.Immunol.2021.51:2151–2163 DOI:10.1002/eji.202049064