CAR-NK用于腫瘤免疫治療的臨床轉化

自然殺傷 (NK) 細胞被認為是修飾 T 細胞的替代品，因為NK細胞固有地缺乏這些缺點。CAR-NK細胞療法比CAR-T細胞療法更安全，正在成為腫瘤免疫領域的研究熱點。同種異體NK細胞移植幾乎不會誘發移植物抗宿主病(GvHD)。此外，NK 細胞來源廣泛，例如外周血(PB)、臍帶血(UCB)、人胚胎干細胞(hESC)、人誘導多能干細胞 (hiPSC)和NK細胞系。NK 細胞分泌IL-3和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，因此不太可能引起CRS。NK細胞分泌的 PD-1 水平顯著降低，幾乎不會引起免疫抑制，這使得NK細胞成為對抗實體瘤的良好候選者。此外，NK細胞促進樹突狀細胞遷移到腫瘤中，從而增強抗PD-1免疫治療。因此，NK細胞在殺傷腫瘤方面發揮著重要作用。CAR-NK細胞療法已在臨床前和臨床試驗中證明可以殺死血液和實體腫瘤細胞，證明其作為具有廣泛臨床應用的現成產品的潛力。

本綜述側重于從臨床前到臨床的轉化、提高治療安全性和有效性的新策略，并描述了CAR-NK細胞治療的挑戰。

CAR-NK細胞的構建與機制

CARs的設計必須考慮到NK細胞的獨特特性，才能進行CAR-NK細胞治療。DNAX激活蛋白(DAP) 12在NK細胞上表達并參與NK激活受體自然殺傷組2(NKG2)成員C和 NKp44的信號轉導。托普弗等人報道，具有DAP12細胞內結構域的CAR在啟動下游信號方面與CD3ζ-CAR一樣有效。

在另一個NK激活受體NKG2成員D(NKG2D)連接后，信號轉導通過DAP10的磷酸化發生，這反過來又招募下游信號效應分子，并最終導致NK細胞分泌細胞因子。這些表達CAR的NK (NKG2D-DAP10-CD3ζ) 細胞對ALL、骨肉瘤和前列腺腫瘤具有很強的抗腫瘤作用。

CAR-NK細胞不僅通過CAR特異性識別表達抗原的腫瘤的能力，而且通過NK細胞受體本身來消除腫瘤。決定NK細胞活性的是刺激和抑制信號的平衡，而不是抗原特異性。這些信號激活銜接蛋白，釋放穿孔素和顆粒酶，并控制細胞因子的產生。Caspase誘導的細胞凋亡是由NK細胞上的FasL與腫瘤表達的配體之間的相互作用引起的。NK細胞的另一種殺傷機制涉及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。

因此，CAR-NK細胞的靶向裂解是基于CAR依賴性和NK受體依賴性機制，并且裂解也適用于具有抗原陰性膜的腫瘤。

CAR-NK細胞治療腫瘤的臨床前成果

最近，CAR修飾的NK-92和原代NK細胞的作用正在血液腫瘤和實體腫瘤中得到廣泛研究。

（1）血液腫瘤的臨床前研究

Romanski等人構建的NK92-CD19-CD3ζ細胞。增強NK細胞的敏感性及其對B系惡性細胞的細胞毒性。Shimasaki等人將CD19-41BB-ζ mRNA轉染到NK細胞中。并且被發現用電穿孔技術穩定表達，隨后光學體內成像顯示，異種移植白血病的生長速度在接受CAR-NK細胞治療后顯著減慢。Chu等人使用核轉染技術，通過與K562-mb-IL15-41BBL 培養，用CD20-BB-ζmRNA和活化的CAR-NK細胞修飾PB-NK細胞，從而增強對利妥昔單抗耐藥伯基特淋巴瘤的細胞毒性并延長小鼠的存活時間。CD138-CAR-NK-92還延長了多發性骨髓瘤(MM)小鼠模型的存活率。有趣的是，CAR-NK92細胞靶向非腫瘤靶點EBNA3C，有效消除Epstein-Barr病毒陽性 T 細胞，展示了它們的巨大潛力（表 1）。

（2）實體瘤的臨床前研究

CS1-CD28/CD3ζ-NK92抑制MM生長，促進IFN-γ分泌，延長荷瘤小鼠的生存期。韓等人構建了具有表皮生長因子受體（EGFR）-CD28-CD3ζ的CAR-NK-92細胞，對膠質母細胞瘤（GBM）細胞具有很強的殺傷作用。GD2特異性 NK-92 [34] 細胞靶向神經母細胞瘤并發揮細胞溶解作用。在骨肉瘤、肝細胞癌 (HCC)、胰腺癌和乳腺癌中觀察到 NKG2D-DAP10-CD3ζ 具有很強的抗腫瘤作用。前列腺干細胞抗原 (PSCA)-DAP12-CAR 被轉染到 PB-NK和YTS-NK細胞中，使它們對PSCA+腫瘤具有溶解作用。

CAR-iPSC-NK細胞顯著抑制小鼠異種移植卵巢癌的生長。源自iPSC的NK細胞可以作為標準化產品大規模生產，這將允許它們通過重復注射以多劑量給藥，從而更有效地治療難治性實體瘤與化療相結合（表 2）。

CAR-NK細胞療法在血液和實體瘤中的臨床轉化

200項關于CAR-T細胞的研究已在clinicaltrials上注冊。然而，只有9項臨床試驗（表 3）涉及來自原代NK細胞和NK細胞系的CAR-NK細胞（圖 1）。

進行了六項臨床試驗以評估CAR-NK92細胞療法的安全性。CD19、CD7和 CD33 靶向淋巴瘤和白血病（NCT02742727、NCT02892695、NCT02944162）。HER2靶向 GBM(NCT03383978)，共刺激轉化受體靶向非小細胞肺癌(NSCLC) (NCT03656705)。粘蛋白 1 (MUC1)靶向多種難治性實體瘤，包括HCC、NSCLC、胰腺腫瘤和三陰性浸潤性乳腺腫瘤(NCT02839954)。

唐等人將 CD33-CAR-NK92細胞注射到10名復發或難治性AML患者體內 [39]。每位患者安全給藥一劑5×109個CAR-NK92細胞，然后可以在PB中檢測到。只有3名患者在治療后出現輕度發熱和CRS，并于次日恢復正常（NCT02944162）。

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圖 1. CAR-NK過繼細胞療法 (ACT) 在癌癥患者中的臨床應用程序。

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已有三項關于源自PB或UCB的CD19-CAR-NK細胞的臨床試驗。在圣裘德兒童研究醫院進行的臨床試驗 (NCT00995137) 招募了14名18歲以下的患者。用CD19-41BBz-CAR轉染的半相同PB衍生NK細胞通過與輻照共培養進行擴增K562-mb15-41BBL。另一項臨床試驗（NCT01974479）目前正在美國國立大學衛生系統進行。NK細胞用抗CD19-BB-zeta mRNA轉染兒童和成人的難治性ALL，劑量為（0.5-1）×108/kg。v. 第三次試驗(NCT03056339)在MD Anderson癌癥中心進行。來自UCB的NK細胞用含有 iCasp9/IL-15自殺基因的CAR轉染，分泌IL-15以支持生存，并表達自殺基因以在藥理激活時消除自身。幸運的是，這種療法在 2017年獲得了批準用于B細胞淋巴瘤的 I/II 期試驗。

CAR-NK細胞療法面臨的改進和挑戰

（1）CAR-NK細胞療法的改進

迄今為止，已經在多種腫瘤模型中對CAR-NK細胞療法進行了廣泛的臨床前研究。患者來源的腫瘤異種移植(PDX) 模型保留了原發性腫瘤的異質性，是臨床癌癥的優秀模型，因為它直接將腫瘤從患者轉移到NSG或NOG小鼠。大多數CAR-NK細胞療法已在臨床前試驗中評估了PDX模型的療效，包括針對血液腫瘤靶標（例如CD19、CD20、CD138和CS-1）的CAR和實體瘤（例如，HER2、GD2、PSCA和 EGFRvIII）。

與PDX相比，人源化小鼠是更準確的模型。它們是通過將人類造血干細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，使其發展出人體免疫系統而產生的，克服了PDX模型無法觀察到CAR-NK/T對宿主免疫細胞TME的影響。CD44v6-CAR-T細胞被移植到人源化小鼠體內，以評估它們對造血干細胞的靶向/非腫瘤毒性。此外，還評估了分泌抗程序性死亡配體 1 (PD-L1) 抗體的碳酸酐酶IX-CAR-T細胞對人源化小鼠腫瘤部位募集NK細胞的影響。

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（2）挑戰和應對策略

盡管CAR-NK細胞療法具有巨大潛力，但仍有一些基本問題需要解決以擴大其臨床應用。首先，目前的CAR是為構建CAR-T細胞而設計的，因此，對于應用于 NK 細胞而言，它不是最佳選擇。CAR結合表位的位置及其與CAR-NK細胞表面的距離會影響它們結合抗原和激活CAR-NK細胞的能力。李等人構建了九個專門針對NK細胞殺死黑色素瘤的 CAR，特別關注細胞內刺激銜接分子，以找到針對 NK 細胞活化和細胞毒性的優化CAR構建體[45]。

其次，逆轉錄病毒轉染可能誘導插入突變，慢病毒轉導效率對PB-NK細胞低。非病毒載體克服了這些缺點，被認為是一種安全且負擔得起的轉導替代方案 。即使在原代靜息NK細胞中，在mRNA電穿孔后24小時CAR表達為82.0%。

第三，NK細胞對凍融過程很敏感。解凍后NK細胞的存活率和細胞毒性顯著降低。一些團隊發現冷凍NK細胞的活性可以通過添加IL-2來部分恢復。必須探索最佳冷凍保存策略，以使 AR-NK細胞療法作為現成產品可行。

最后，同種異體 NK 細胞可能被T細胞污染，導致GvHD或淋巴增殖性疾病 。前淋巴細胞缺失可能會完全去除T細胞。此外，調節性T細胞和髓源性抑制細胞也受到影響，這在NK細胞治療中起負面作用。另一種方法是建立最佳的臨床級方案，用于純化最終對患者安全的NK細胞。

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提高安全性和有效性的新策略

（1）提高CAR-NK細胞治療的安全性

將自殺基因整合到CAR結構和雙特異性CAR分子可用于提高CAR-NK細胞治療的安全性。1990年代干細胞移植后首次使用HSV-TK/GCV自殺系統。Fas和caspase 9等凋亡途徑已被使用。目前，含有自殺基因的GD2-CAR-T細胞（NCT01822652）用于治療肉瘤和神經母細胞瘤的I期臨床試驗正在進行中。CAR 掩蔽肽由阻斷抗原結合位點的掩蔽肽和蛋白酶連接組成。當蛋白酶切割的連接與TME中的掩蔽肽分離時，CAR-T 細胞可以在局部腫瘤部位保持活躍。氧敏感CAR 是通過將 HIF1的氧敏感子域與CAR結構融合而設計的。

此外，CAR-T被設計為在SynNotch和CAR配體在腫瘤上共表達時激活，這是一種空間識別和有效控制CAR-T細胞激活的策略。

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（2）提高CAR-NK細胞治療的療效

在CAR-NK細胞的設計過程中沉默NK抑制受體使它們對腫瘤更具抵抗力。當 IL-4和IL-7受體結構域與反向細胞因子受體(4/7 ICR)融合并添加到CAR構建體中時，一些研究小組發現源自腫瘤的 IL-4 的抑制作用降低，增殖促進了CAR-T細胞的發展。CAR/ICR轉染的T細胞在體內含有IL-4的TME中發揮持續的抗腫瘤作用。考慮到CAR-NK細胞的特異性，ICR受體（IL-15、IL-21）是否適用于CAR-NK細胞的策略需要進一步確定。有趣的是，CAR-T/NK 細胞維持著固有的代謝過程。以 4-1BB作為共刺激分子的CAR-T細胞依賴于氧化代謝，增強 T 細胞的線粒體活性、增殖和持久性，并增強抗PD-1活性。因此，可以通過調節CAR-T/NK細胞的代謝來提高治療效果。

隨著未來幾年提供更多的臨床數據，CAR-NK細胞療法可能會導致腫瘤免疫療法的革命性進展。