Cells | 再生醫學的未來：使用多能干細胞的細胞療法和基于細胞外囊泡的無細胞療法

2021年10月28日Cell期刊發表了一篇題為The Future of Regenerative Medicine: Cell Therapy Using Pluripotent Stem Cells and Acellular Therapies Based on Extracellular Vesicles的文章，全面綜述了再生醫學的未來：使用多能干細胞的細胞療法和基于細胞外囊泡的無細胞療法。文章主要內容翻譯如下：

文章提到，干細胞研究領域的快速進展為其在受傷或患病組織的再生藥物應用中使用了強大的基礎。增長證據表明，一些觀察到的干細胞療法的治療結果是由于旁分泌作用而不是移植細胞的長期植入和存活。鑒于它們對生物屏障和介導生物活性分子的細胞間信息轉移的能力，細胞外囊泡被探索為潛在的無細胞治療劑。

在許多疾病的背景下，特定細胞類型的退化和/或功能障礙會影響組織和器官，這會隨著時間的推移而惡化并失去其功能。在這種情況下，再生醫學為否則仍未治療的病理學提供了新的視角。

細胞來源

已經考慮了各種細胞來源用于細胞療法和再生藥物，包括來自活體供體或尸體，胎兒材料和多能干細胞系的成人材料。

來自成人來源的細胞材料可以直接從患者獲得，并在體外純化/擴增（如間充質干細胞（MSC）或來自皮膚上皮細胞）。這種自體方法可防止拒絕的風險。然而，基于自體細胞的治療產品的制造過程和供應物流非常復雜并且阻礙了它們的發展。當涉及年齡相關黃斑（AMD）或治療所需的細胞數量很重要時，這些限制是尤為重要的。

用于細胞療法的另一個材料來源是胎兒。收獲細胞保留了優于成人細胞的增殖潛力。盡管胎兒莖/祖細胞受到限制的潛力，但產生有限的細胞類型，但其中一些細胞不再存在于成人組織中，因此可以用于產生特異性細胞類型。盡管如此，他們的訪問是世界各地的高度變化，具體取決于每個國家的墮胎法和政策。事實上，在一些國家，嚴格禁止。

人誘導多能干細胞（HiPSC）被認為是再生醫學的有前途的細胞來源。HiPSC是自我可再生的，產生任何人體的細胞類型。HiPSC可以與良好的培養工藝（GMP）設施和質量控制實現大規模工業生產，這與任何其他更傳統的藥品一樣。

基于 hPSC 的細胞療法：精選示例

視網膜變性

視力障礙的不同原因，例如 AMD、色素性視網膜炎 (RP) 和糖尿病性視網膜病變，其特征是眼睛的光敏部分：視網膜退化。根據疾病的性質和/或階段，不同的細胞類型容易退化。特別是，視網膜色素上皮 (RPE)，一種在 AMD 和某些形式的 RP 中受影響的視網膜的重要支持組織，會引發光感受器 (PR) 的退化。因此，為了防止 PR 退化和隨后的視力喪失，出現了一個特定的焦點來替換死亡或功能失調的 RPE 細胞。

在過去的十年中，已經開發了幾種基于自發分化的方法來將 HiPSC 轉化為 RPE 細胞。分化是由 FGF2 退出（用于維持 HiPSC 的多能性狀態）啟動的。幾周后，在培養的細胞中開始出現色素簇。這些簇對應于 RPE 細胞，可以手動分離然后擴展。在該過程結束時，hPSC-RPE 細胞儲存在冷凍管中，可以按需解凍。

這些 ?HiPSC-RPE 細胞的治療潛力在作為細胞懸浮液注射到內源性 PR 和 RP 大鼠模型的 RPE/布魯赫膜之間的視網膜下空間后進行了評估。所有這些研究都證明了 hPSC-RPE 細胞具有保護 PRs 和恢復視覺功能的好處。最近通過在不同支架上重建有組織的 RPE 上皮對最終配方進行優化，提高了移植物的存活率和治療效果。這種作為有組織的組織的配方需要開發特定的裝置來制備治療產品并將其輸送到眼睛。

皮膚傷口愈合與修復

皮膚傷口主要由創傷或熱燒傷引起，可以由身體自修復。自傷愈合的不同階段包括：（1）止血，以阻止血液損失，并為細胞遷移提供支架，（2）炎癥，以消除病原體和組織碎片，特別是角質形成細胞的增殖，以實現傷口覆蓋（4）通過皮膚成纖維細胞分泌的膠原蛋白的重塑。然而，愈合過程可以通過傷口的大小，環境因素（壓力，吸煙，藥物或娛樂藥物）或影響皮膚或傷口愈合能力的遺傳障礙的愈合過程損害。

閉塞式敷料可以應用于傷口，以通過提供機械保護和潮濕和清潔的環境來改善愈合，這些環境有利于重新上皮化。當這是不夠的時，由表皮祖細胞的體外膨脹可以獲得不同的外部生物或自體細胞的皮膚替代物。

這些皮膚替代物可以由表皮，皮膚或Dermo-Ebidermal（復合）層組成。例如，來自供體的自體角質形成細胞的片材在體外膨脹以產生大表皮片。然而，這種方法是耗時的，并且在嚴重的燒傷的情況下，為生成角質形成細胞的現成銀行的策略將改善患者護理。這種目標是通過制備來自HPSCS的皮膚替代品來實現，這促進了適用于大規模使用和臨床相容的工業生產的大型細胞庫的生產。

HPSC已經成功地分化為基礎角蛋白細胞，能夠在嚙齒動物體外和體內形成多個異丙表皮。然而，根據疾病背景，應控制炎癥，應促進血管生成以保持移植物。因此，需要復雜的組織工程來改善移植物整合和生存。內皮細胞，成纖維細胞和膠原蛋白可以是重建皮膚的一部分，以模仿皮膚層并有利于血運重建。

使用多種細胞類型的固有難度是它們正確的空間組織來重建復雜的皮膚結構，以確保移植物的功能整合。有希望的結果是使用皮膚替代物中的具有IPSC衍生的內皮細胞的微觀圖案化的3D血管網絡獲得，具有更好的植入和長期存活以及在免疫缺陷小鼠中接枝時的改善的功能。實際上，皮膚衍生的細胞外基質生物導芯減少了使用膠原蛋白觀察到的收縮和收縮。此外，它有利于上皮組織和障礙功能。

心臟梗塞治療

盡管介入和藥物治療療法進展，但心力衰竭是全世界人死亡的第一個原因。與低脊椎動物相比，人心肌或心肌幾乎沒有再生潛力，丟失的組織被纖維化疤痕所取代。現有的治療不是治愈性的，并且不會引發心臟再生。細胞療法可以通過將相同的收縮性能的移植與心肌細胞分享相同的收縮性質來解決這種瓶頸。

已經開發了各種方案以從3D或2D培養物中產生來自HPSC（HPSC-CMS）的心肌細胞，其中一些具有高產率和使用生物反應器的純度。例如，HPSC通過暴露于BMP-2致力于心臟中胚層譜系。然后通過抑制SU-5402的成纖維細胞生長因子受體將心血管祖細胞保持在祖細胞中。或者，WNT信號通路的時間調節（即，初始激活，然后抑制）足以觸發HPSC-CM分化。HPSC-CMS顯示心肌細胞的一些主要特征，如收縮性，離子通道，鈣處理和激發繁殖。

已經在嚙齒動物和較大的動物（豬或靈長脂）中進行了HPSC-CM功能的臨床前評價。通過肌內途徑或組織工程之后將細胞作為細胞懸浮液遞送。在將同種異體PSC-CMS或HESC-CMS注射后，作為心肌梗死的靈長類動物的細胞懸浮液，心臟收縮功能改善了。此外，證明PSC-CMS的注射優于骨骼肌細胞或MSCs，用于恢復缺血性損傷的豬模型中的心臟功能和氧氣消耗。

使用細胞外囊泡（ EV）的臨床試驗

近年來，越來越多的研究表明，細胞外囊泡（外泌體）作為活性劑或遞送系統可能具有顯著的治療潛力。EV 主要被開發為用于抗腫瘤/免疫調節療法、藥物輸送和再生療法的工具 。此外，EV 在探測宿主的病理生理狀態方面被廣泛研究，作為生物體液中潛在的生物標志物，用于診斷和監測各種疾病。

近年來，正在進行、計劃中或已完成的臨床試驗越來越多。為了評估 EV 在轉化臨床試驗中的使用，我們在 ClinicalTrials.gov 網站上搜索了關鍵詞“外泌體”、“細胞外囊泡”或“微囊泡”。結果顯示了與疾病背景和 EV 來源相關的每個 EV 亞群。

到目前為止，大多數研究都調查了 EV 作為生物體液（如血液和尿液）中可靠生物標志物的用途，用于診斷和預后。來自樹突狀細胞和腫瘤細胞的 EV 的免疫調節特性也正在探索作為無細胞抗腫瘤劑。已在 I 期和 II 期臨床研究中獲得了有希望的結果。一項 II 期臨床試驗 (NCT01159288) 評估了載有主要組織相容性復合體 (MHC) I 類和 II 類限制性癌抗原的樹突狀細胞 (DC) 衍生的 EV 作為誘導化療后無法手術非手術患者的維持免疫療法的治療潛力。-小細胞肺癌 (NSCLC) 。這項 II 期試驗表明，DC 衍生的 EV 在晚期 NSCLC 患者中發揮 NK 細胞效應功能，增強了抗腫瘤免疫的 NK 臂。

最近的注意力集中在 EV 作為脫細胞再生醫學的治療工具的潛在興趣上。30 項介入性臨床試驗基于 EV 用于治療目的。其中只有 16 個專門評估干細胞衍生的 EV 在患者中的治療效果和安全性。

越來越多的證據表明，EV 可以在許多應用中重現其親代細胞的有益作用。為了與我們之前的部分進行比較，我們將在此重點介紹使用 EV 作為影響眼睛、皮膚、心臟和骨骼肌的疾病的治療工具獲得的最新進展。我們還探索了如何整合基于細胞的療法和無細胞療法，以利用這兩種方法的優勢并增強治療效果。

眼睛修復問題

已經評估了 EV 對 RP、AMD 和眼部損傷后的治療效果。大多數這些研究都集中在 EV 限制炎癥的潛力上，否則炎癥會引發視網膜細胞的死亡 。如前所述，不同的研究已經開始表明，產生有益效果可能不需要細胞的存在。例如，人類神經祖細胞的視網膜下植入通過旁分泌效應保留了 RP 模型的視力。

在模擬 RP 和人類患者的大鼠中，人胎視網膜祖細胞也引起了相同的效果。由于這些移植是在 PR 變性之前進行的，因此顯然不希望替換死細胞。在此基礎上，在視力喪失之前，將源自神經祖細胞的 EV 注射到造模 RP 的大鼠的視網膜下。單次注射后，視覺功能和 PR 存活率得到暫時改善（最多 28 天后手術）。EVs 主要由從內部視網膜遷移到視網膜下空間的 Iba1+ 小膠質細胞內化。EV 誘導促炎細胞因子的下調并抑制小膠質細胞，其抑制激活與 RP 中的 PR 存活有關。

皮膚傷口愈合

由大面積燒傷、感染或外傷引起的嚴重皮膚損傷需要醫療干預才能正常愈合。治療策略旨在促進皮膚傷口愈合的 4 個階段——穩態、炎癥、增殖、重塑——以加速傷口修復和再生。這些階段的分子和細胞事件緊密協調，許多細胞類型以高度協調的順序相互作用以恢復受損組織。

EVs 具有促進傷口愈合各個階段和促進皮膚再生的潛力。從炎癥階段過渡到增殖階段是成功傷口愈合的關鍵步驟。在炎癥的早期階段，絕大多數巨噬細胞向促炎 (M1) 表型分化。

隨著傷口成熟，該比率轉變為促進組織重塑和傷口愈合的 M2 表型。從脂多糖預處理的 MSC 中獲得的 EV 可以將 M1 巨噬細胞極化轉化為 M2 表型，從而減輕炎癥，并通過穿梭 let-7b miRNA 促進大鼠糖尿病皮膚傷口愈合。同樣，MSC 衍生的 EV 通過 miR-223 調節巨噬細胞極化，促進小鼠皮膚傷口愈合。與這些結果一致，hUCMSCs 顯著降低了炎癥細胞的數量和促炎細胞因子 TNF-a、IL-1、IL-6 的水平，同時增加了重度燒傷大鼠傷口中抗炎細胞因子 IL-10 的產生。同一團隊后來發現，hUCMSC 衍生的 EV 中的 miR-181c 表達通過下調 TLR4 信號通路減少了燒傷誘導的過度炎癥。

心臟疾病

EVs 已被研究為各種心臟病（如缺血性心臟病和心肌梗塞）的有希望的治療選擇。主要目標之一是促進血管修復機制，以減少會導致細胞死亡的心肌損傷，從而改善心臟功能。

hESC 衍生的 MSC 條件培養基 (hESC-MSC-CoM)，用臨床兼容的過程收集，顯示含有易調節心血管相關途徑的因素。hESC-MSC-CoM 的管理概括了在心肌梗塞后的情況下注射 hESC-MSC 的益處。實際上，在心肌梗塞的豬模型中，hESC-MSC-CoM 靜脈內治療 7 天可增強毛細血管密度，減少心肌梗塞面積并保留收縮和舒張功能。此外，在另一種豬缺血再灌注損傷模型中，hESC-MSC-CoM 減少了心肌細胞凋亡和氧化應激。該 hESC-MSC-CoM 含有 50-100 nm 的大顆粒，這些顆粒經過純化并表征為 EV。在心肌缺血和再灌注損傷的離體小鼠模型中，hESC-MSC 衍生的 EV 同樣減少了梗死面積。

骨骼肌

嚴重的肌肉損傷和肌營養不良癥等遺傳缺陷會導致肌纖維死亡。再生骨骼肌纖維的自發修復確實發生，但還不夠。治療方法的一個中心目標是通過重新填充衛星細胞生態位、促進血管化同時抑制纖維化形成和刺激收縮性肌纖維的形成來重建肌肉結構的完整性和功能性。已經提出了幾種具有肌源性或非肌源性來源的細胞候選物用于骨骼肌再生，并且它們的移植已成為廣泛研究的治療策略。然而，在通過注射遞送細胞后觀察到的大量供體細胞死亡和細胞分散限制了它們的治療潛力。細胞治療產品距離重建肌肉結構還有很長的路要走，更不用說用神經和足夠的血管重建它了。總體而言，可以考慮針對小肌肉進行細胞療法，但對于影響全身肌肉的疾病難以實施。

越來越多的證據表明，EV 由骨骼肌細胞積極產生，并有助于肌肉修復和再生。例如，在人類骨骼肌成肌細胞 (HSkM) 分化為肌管期間分泌的 EV 含有特定的生化線索，可促進和調節人類脂肪干細胞 (HASC) 的肌源性分化。

與對照組相比，用這些分化的 HSkM 衍生的 EV 治療撕裂的肌肉部位導致肌肉再生得到改善，大量再生肌纖維與最小纖維化相關。除了促進肌纖維修復外，EV 還可以減弱過度的 ECM 沉積，以實現最佳的肌肉重塑。

在肌營養不良癥和嚴重的肌肉損傷中，纖維化細胞過度活化和過度增殖，導致骨骼肌被無功能的纖維化組織取代。這種細胞外基質成分的過度積累不僅會改變肌肉功能，還會減少可用于治療和修復的組織數量。建立新的抗纖維化治療策略是改善患者肌肉功能的主要臨床選擇之一。

為響應肥大刺激，衛星細胞產生能夠分泌含有 miR-206 的 EVs 的生肌祖細胞 (MPCs)，其通過鄰近成纖維細胞的核糖體結合蛋白 1 (Rrbp1) 抑制細胞膠原蛋白的表達，從而防止過度的 ECM 沉積。類似地，來自 DMD 患者肌肉活檢組織的成纖維細胞分泌的外泌體的 miR199a-5p 水平升高，導致骨骼肌和周圍基質中的纖維化增加。這些數據表明 EV 作為潛在的抗纖維化劑可能會引起人們的興趣。

正如所討論的，細胞療法觀察到的一些好處可能是由于旁分泌作用可以由這些細胞衍生的 EV 重現，而不是移植細胞的長期植入和存活。總體而言，EV 和移植細胞可以根據目標器官引起不同的結果。在某些情況下，治療效果可能相似，因此，EV 治療可能具有最高的效益/風險比。在其他情況下，兩種療法是互補的，兩者結合可能會達到最佳治療效果。