本文作者Hiraku Tsujimoto,Kenji Osafune，來自于日本京都大學 iPS 細胞研究與應用中心 (CiRA)和明治大學國際生物資源研究所，原標題Current status and future directions of clinical applications using iPS cells—focus on Japan ( FEBS Journal )。
近年來，使用 iPS 細胞技術的再生醫學取得了顯著進展。在這篇綜述中，兩位作者總結了這些技術及其臨床應用。首先，他們討論了 iPS 細胞建立的進展，包括日本的 HLA-homo iPS 細胞資源儲備項目和使用基因組編輯技術的低抗原 iPS 細胞的進步。然后，他們描述了基于 iPS 細胞的療法在或接近臨床應用中的應用，包括用于眼科、神經、心臟、血液、軟骨和代謝疾病的療法。接下來，他們介紹了從患者 iPS 細胞生成的疾病模型，并成功地用于識別難治性疾病的治療劑。通過充分利用現有科學標準，利用 iPS 細胞的臨床醫學已經安全有效地推進，但細胞安全性測試需要進一步開發和驗證。未來幾年將看到基于 iPS 細胞技術的再生醫學的進一步普及。
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通過報告誘導多能干細胞?(iPS)?，Yamanaka 及其同事克服了與使用胚胎干 (ES) 細胞相關的破壞人類囊胚的主要倫理問題。他們發現四種因子 OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC (OSKM) 的組合足以將小鼠和人類體細胞重新編程為 iPS 細胞。
由于 iPS 細胞具有在體外無限擴增并分化成體內任何細胞類型的潛力，因此可用于生成各種分化細胞，用于細胞治療、疾病建模、藥物發現和毒理學篩選。
對于細胞治療，由于該技術最初使用基因組整合病毒作為載體，因此存在將病毒整合到癌癥相關基因附近位置的染色體中，導致腫瘤發生的風險。然而，此后已經開發出安全的方法，例如使用不能摻入染色體的游離型質粒，加速 iPS 細胞向臨床應用。
由于基因組編輯技術的最新進展，現在可以快速準確地生成具有導致疾病的遺傳易感性的疾病特異性 iPS 細胞。隨后針對許多頑固性疾病進行了疾病建模研究，其中疾病特異性 iPS 細胞分化為受損細胞類型或組織，以在體外重現疾病表型。
在本文中，兩位科學家討論了旨在利用 iPS 細胞徹底改變醫學的新技術?；?iPS 細胞技術的臨床試驗正在美國、中國、德國和其他國家進行（NCT03763136、NCT03759405、NCT04396899、NCT04106167、NCT03841110 和 NCT04245722），但在撰寫本文時，通過 iPS 細胞資源儲備項目，在日本進行的臨床試驗比其他任何地方都多。因此，他們在這篇綜述中將注意力集中在日本的臨床研究上。
安全臨床應用技術
iPS細胞的建立
建立iPS細胞的方法可以根據重編程方法大致分類，包括逆轉錄病毒，慢病毒，仙臺病毒，腺病毒, 質粒, 游離型質粒, 轉座子, 小環 DNA ], RNA , 蛋白質, 和分子化合物。
它們可以根據效率和安全性進一步分類；即重編程的效率、技術難度和整合到基因組中的風險。通常，效率和安全性呈負相關。因此，首選的重編程方法將取決于研究目的。由于安全問題較少，因此基礎研究首選有效方法。另一方面，在臨床應用中，安全性至關重要。
iPS 細胞的第一份報告涉及使用逆轉錄病毒載體對 OSKM 轉錄因子進行基因轉移。從歷史上看，經驗表明用病毒治療需要謹慎。例如，最初，在法國、澳大利亞和英國對免疫缺陷患者進行的使用逆轉錄病毒載體進行基因治療的創新臨床試驗被認為是成功的。
然而，后來人們意識到將病毒載體插入基因組會導致嚴重的并發癥，包括由于原癌基因的過度表達而導致白血?。?0 名患者中有 5 名）的發展，甚至導致一名患者死亡 。
同樣，由病毒載體建立的 iPS 細胞制備的細胞也有發生惡性腫瘤的風險。此外，人們普遍認為逆轉錄病毒對 c-Myc 的穩定基因組整合可引起致瘤性。因此，原有的重編程方法被禁止臨床應用。
其他重編程因子可以降低致瘤性。理想情況下，外源重編程因子不會整合到染色體中。DNA載體如游離質粒就是例子?；?RNA、蛋白質或小分子化合物的方法整合到基因組中的風險最小，但在技術上很困難。
最終，使用編碼 OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28 和 TP53 的 shRNA 的附加型質粒載體產生了安全和高效的 iPS 細胞，所有日本研究都已發展到臨床應用正如我們在下面討論的，使用 iPS 細胞已經采用了這些附加型載體。Fate Therapeutics, Inc. 的幾項臨床試驗（NCT04106167、NCT03841110 和 NCT04245722）也使用附加型質粒載體。
iPS細胞維持培養基的開發
人類多能干細胞 (iPS/ES 細胞) 的培養傳統上是在補充有血清替代品和成纖維細胞生長因子 2 (FGF2) 的培養基中進行的，使用小鼠成纖維細胞作為飼養細胞。作為 iPS 細胞臨床應用的第一步，已經開發了許多使用專用培養基和無飼養細胞的細胞外基質的無飼養細胞培養方法。
京都大學 iPS 細胞研究與應用中心 (CiRA) 開發了“StemFit”，一種不含動物來源成分的 iPS/ES 細胞培養基。然而，所有這些培養基都含有生長因子蛋白，例如 FGF2，而且價格昂貴。最近，已經開發出相對便宜且穩定的小分子化合物（1-Azakenpaulllone、ID-8 和他克莫司），使生長因子變得可有可無。
| iPS cell stockpiling project
HLA-homo?iPS 細胞資源庫（HLA-homo iPS cell stock）
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京都大學 CiRA 基金會的 iPS 細胞儲備項目正在開發用于再生醫學，并使用來自健康供體的血液樣本，這些供體與人類白細胞抗原的三個位點（人類白細胞抗原；HLA-A、HLA-B 和HLA-DRB1)，這使得移植不太可能引起免疫排斥。
在自體移植的情況下，iPS 細胞從患者的血液或其他體細胞中產生并檢查質量。接下來，iPS細胞被分化成用于患者治療的細胞并移植。盡管 iPS Cell Stock Project 中使用的 iPS 細胞系是同種異體的，但與自體移植相比，它們可以節省時間和成本。
在這個項目中，CiRA 基金會在其準備設施中生成 iPS 細胞。之后，它只儲存已確認安全的質量有保證的 iPS 細胞，并將其提供給日本和國外的醫療和研究機構，用于包括臨床應用在內的醫學研究目的（圖 1）。
截至 2021 年 3 月，來自 7 個 HLA 純合子 (HLA-homo) 供體的 iPS 細胞可供使用，估計覆蓋約 40% 的日本人口。然而，HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRB1 純合 iPS 細胞供體非常罕見。因此，要收集覆蓋日本約 90% 人口的 140 種類型，需要大量時間和成本。事實上，據估計，必須檢查多達 16,000 人的人類白細胞抗原類型才能找到 140 種類型。
圖1：iPS 細胞儲備項目示意圖。HLA 純合供體捐獻外周血，從中產生 iPS 細胞的細胞資源庫。
HLA 同源 iPS 細胞增加了供體與患者匹配進行細胞治療的可能性。然而，一些免疫學問題仍然存在。在 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRB1 純合移植的情況下，NK 細胞的排斥可能因 HLA-C 的錯配而發生。另一個問題是次要組織相容性抗原的錯配，這是一種蛋白質的氨基酸序列因人而異的多態性，因此蛋白質的一部分充當抗原。因此，即使是 HLA 匹配的移植物，移植物也可能最終被排斥，除非患者服用免疫抑制藥物。
低抗原性iPS細胞
與 HLA 同源 iPS 細胞原液同時開發的另一種方法是生成基因編輯的低抗原性 iPS 細胞。人類白細胞抗原基因分為1類、2類和3類。呈遞抗原的人類白細胞抗原有1類和2類分子。
人類白細胞抗原 1 類分子（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）在所有有核細胞上表達，并將來自致病和轉化腫瘤細胞的抗原呈遞給 CD8+ 細胞毒性 T 細胞。人類白細胞抗原 2 類分子（HLA-DP、HLA-DQ 和 HLA-DR）幾乎只在抗原呈遞細胞（如巨噬細胞和樹突細胞）上表達，并激活 CD4+ 輔助 T 細胞。
作為 HLA 同源 iPS 細胞的替代品，最近的研究報告了使用基因組編輯技術敲除 B2M 和 CIITA 基因的方法。
B2M是在細胞表面構建和呈遞人白細胞抗原1類分子的重要蛋白質，而CIITA是人白細胞抗原2類分子表達所必需的。
敲除 B2M 基因會導致所有人類白細胞抗原 1 類蛋白從細胞表面消失。人類白細胞抗原 1 類分子通過將其抗原呈遞給殺傷性 T 細胞來識別外來細菌和病毒，并且僅當包括呈遞抗原的人類 1 類白細胞抗原被識別為非自身時才會啟動免疫反應。
因此，供體細胞中人類白細胞抗原 1 類分子的損失使細胞能夠逃避受體殺傷性 T 細胞的攻擊。相反，被人類白細胞抗原 1 類分子抑制的 NK 細胞被激活并開始攻擊供體細胞。此外，供體細胞喪失人類白細胞抗原 1 類抗原呈遞能力可能使它們能夠逃避受體的殺傷性 T 細胞，即使它們感染了病原體或已獲得致癌性。
使用 CRISPR-Cas9 基因組編輯技術，Shin Kaneko 和 Akitsu Hotta 小組開發了兩種方法來生成具有低免疫排斥風險的 iPS 細胞。
第一種方法通過基因組編輯常見的HLA-雜合供體來源的iPS細胞選擇性地去除一條染色體上的人類白細胞抗原基因，以產生人類白細胞抗原偽純合iPS細胞。
研究表明，人類白細胞抗原假純合 iPS 細胞衍生的血細胞在體外受到假設受體的殺傷性 T 細胞的攻擊的可能性低于未經編輯從 iPS 細胞分化而來的血細胞。雖然這種方法可以為各種人類白細胞抗原類型生成偽純合子，但需要有多種 HLA-A/B/C 組合才能儲存與每種類型兼容的細胞。
因此，在第二種方法中，該研究制備了 iPS 細胞，其中一種基本類型的 HLA-C 被保留，所有其他 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C 被刪除。
已知 HLA-C 對抑制 NK 細胞活性很重要。從理論上講，這種方法比第一種方法需要更少的供體來覆蓋更大的人群，因為只需要匹配 HLA-C 類型即可降低排斥風險。
該研究證實，這些 iPS 細胞系產生的細胞在體外不太可能受到虛擬受體的殺傷性 T 細胞和 NK 細胞的攻擊。通過這種方法僅考慮人類白細胞抗原 1 類，估計 7 個 iPS 細胞系足以覆蓋 95% 以上的日本人口。然而，如果受體的 C 型是雜合的，則供體細胞將受到宿主 NK 細胞的攻擊。因此，需要進一步研究以使 iPS 細胞療法適用于整個人群。此外，必須調查脫靶突變的風險。
致瘤性測試
要在臨床上使用 iPS 細胞衍生的細胞產品，需要進行腫瘤發生試驗。這是由于iPS細胞維持和分化的培養過程中可能出現惡性轉化的細胞，以及iPS細胞本身具有致瘤性。
已經報道了與干細胞治療相關的腫瘤形成，無論是自體還是同種異體細胞。在這種情況下，如果細胞是自體的，那么它們通常逃避免疫的事實可能會適得其反。
目前，需要對 iPS 細胞治療產品進行測試，以證明未分化的 iPS 細胞沒有殘留，并且最終的細胞產品不具有致瘤性。上述人類白細胞抗原基因編輯細胞可能會增加腫瘤發生的風險，因為它們能夠逃避腫瘤免疫以及基因組損傷和癌癥相關基因脫靶突變的風險。應該進一步調查這些風險，并且需要更仔細地進行腫瘤發生研究。
對于體外殘留 iPS 細胞的檢測，已經報道了幾種方法：流式細胞術、定量 RT-PCR、液滴數字 PCR、iPS 的有效培養方法細胞生長，檢測釋放到培養基中的標記分子，并用磁珠富集。為了在體外檢測惡性轉化的細胞，已經報道了三種方法：細胞增殖測定，檢測不依賴貼壁的細胞生長，以及檢測基因組不穩定性。
使用 iPS 細胞的細胞療法
年齡相關性黃斑變性和色素性視網膜炎
年齡相關性黃斑變性 (AMD) 是一種影響視網膜黃斑區域的進行性疾病，導致中央視力逐漸受損。晚期 AMD 導致中心視力喪失，導致嚴重和永久性視力障礙，這對生活質量和功能獨立性產生重大影響。如果早期發現疾病，可以在一定程度上阻止進展，并使用抗血管內皮生長因子（VEGF）治療將損害降至最低；然而，AMD 仍然是全球嚴重不可逆視力喪失的第三大原因（圖 2，表 1）。
圖2：在日本正在進行的基于 iPS/ES 細胞的細胞療法的臨床試驗。方框中的名稱表示疾病，而方框下方的名稱表示移植的 iPS 細胞產品的類型。
表 1. 目前在日本進行的與圖 2 相關的臨床試驗。AMD，年齡相關性黃斑變性；ALS，肌萎縮側索硬化癥；AD，阿爾茨海默??；FOP，進行性骨化纖維發育不良。
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Target disease |
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Drug |
Cell type |
References |
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Drug discovery |
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ALS |
Bosutinib |
Motor neurons |
UMIN000036295 |
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ALS |
Ropinirole hydrochloride |
Motor neurons |
UMIN000034954 |
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AD |
Bromocriptine |
Cortical neurons |
NCT04413344 |
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Pendred syndrome |
Sirolimus |
Inner ear cells |
UMIN000033083 |
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FOP |
Sirolimus |
Mesenchymal stromal cells |
UMIN000028429 |
Masayo Takahashi 小組研究了在滲出性 AMD 患者中移植從 iPS 細胞分化而來的視網膜色素上皮 (RPE) 細胞片的可行性。iPS 細胞由兩名晚期 AMD 患者的真皮成纖維細胞產生并分化為 RPE 細胞。
詳細檢查了生成的 RPE 細胞及其親代 iPS 細胞的質量。在這兩名患者中，一名患者接受了自體 iPS 細胞衍生的 RPE 細胞片的脈絡膜新生血管和視網膜下移植手術。術后一年，研究小組報告移植的 RPE 細胞片已成功移植，視力保持不變。
該小組隨后進行了一項臨床研究，將由 HLA 同源 iPS 細胞產生的 RPE 細胞移植到 HLA 匹配的滲出性 AMD 患者中。給予沒有免疫抑制藥物的局部類固醇。在接受移植的所有五例病例中，經過一年的觀察期后證實存在移植細胞，沒有異常生長。
觀察到的不良事件包括輕度炎癥、疑似輕度排斥反應、視網膜水腫、角膜上皮脫離和無菌性眼內炎。這些不良事件均未導致研究中止。盡管研究人員建議應進一步改進細胞遞送策略，但中期結果表明移植的 HLA 匹配的同種異體 iPS 細胞原種來源的 RPE 細胞在一年后的穩定存活和安全性。
盡管再生被認為是中樞神經系統一部分的視網膜的嘗試非常具有挑戰性，但他們還將 iPS 細胞原種來源的視網膜細胞片移植到兩名患有色素性視網膜炎 (jRCTa050200027) 的患者體內，這是一種遺傳性以視網膜進行性退化和功能障礙為特征的營養不良。
視網膜色素變性的全球患病率約為 4000 分之一。目前，沒有可用的治療方法，患者經歷進行性夜間和周邊視力喪失，最終失去中心視力，通常在 60 歲時。作為這種方法的基礎，該團隊證實了在小鼠模型中移植人類 ES 細胞衍生的視網膜片可以改善視力。
角膜緣干細胞缺乏癥
角膜鞏膜緣上皮干細胞的正常功能是角膜上皮維持和再生的先決條件。一般認為，這些上皮干細胞存在于角膜緣的基底上皮，是透明角膜和不透明鞏膜之間的過渡區。
因此，這些細胞被稱為角膜緣上皮干細胞 (LSC)。正常的角膜緣和 LSC 可作為屏障，防止結膜上皮侵入角膜表面。LSC 維持角膜上皮的正常穩態和傷口愈合。
當結膜上皮侵入角膜，角膜表面被包括血管在內的結膜組織覆蓋時，會出現嚴重的角膜混濁，導致視力障礙和失明。LSC 缺乏可能是由遺傳缺陷或對 LSC 及其生態位的繼發性損傷引起的，這可能導致角膜上皮傷口愈合異常和/或角膜表面結膜化。
原因包括燒傷、堿性或酸性腐蝕、史蒂文斯-約翰遜綜合征和眼類天皰瘡。供體角膜移植已用于治療可導致失明的嚴重角膜上皮疾病，但存在排斥反應和供體短缺的問題。
為了應用基于 iPS 細胞的療法，Koji Nishida 小組開發了一種二維 (2D) 培養系統，即“SEAM（自形成外胚層自主多區）方法”，通過促進分化的iPS細胞的自組織。SEAM 方法誘導由四個同心帶狀結構組成的二維組織。構成發育中的眼睛的主要細胞群，如角膜上皮、視網膜和晶狀體上皮，出現在組織的特定區域。
研究小組從二維組織的第三條帶結構中分離出角膜上皮祖細胞，并成功生產出功能性角膜上皮組織。此外，他們通過將人類 iPS 細胞衍生的角膜上皮組織移植到動物模型中來證明其治療效果。基于該技術的臨床研究于 2019 年開始。
簡而言之，將源自 HLA 同源 iPS 細胞原種的角膜上皮細胞片移植到四名患有嚴重角膜上皮干細胞衰竭的患者體內。三個人類白細胞抗原位點與 iPS 細胞衍生的角膜上皮細胞片不相容的前兩名患者使用了免疫抑制劑。將對這兩個案例進行中期評估，以確定在以下兩個案例中是否使用人類白細胞抗原相容或不相容的細胞片（UMIN000036539）。
帕金森病
當中腦黑質中的多巴胺神經元由于某種原因受損，從而減少多巴胺的產生量時，就會發生帕金森病。在阿爾茨海默病 (AD) 之后，帕金森病是第二常見的神經退行性疾病，在美國 40 歲的男性和女性的剩余終生風險分別為 2% 和 1.3%。
Jun Takahashi 小組于 2018 年 8 月開始使用 iPS 細胞衍生的多巴胺神經祖細胞治療帕金森病的臨床試驗（UMIN000033564）。用于移植的細胞從 HLA 同源 iPS 細胞原液中分化出來，并通過 FACS 分選 CORIN 進行純化，CORIN 是一種細胞表面標記物，他們顯示對多巴胺神經祖細胞具有特異性。
在臨床試驗之前，他們證實了移植的人 iPS 細胞衍生的多巴胺神經祖細胞在食蟹猴帕金森病模型中的有效性和安全性。移植的猴子表現出增加的運動活動和帕金森病癥狀的改善。正電子發射斷層掃描分析表明，移植的細胞在大腦中合成了多巴胺。此外，兩年隨訪后未觀察到腫瘤形成，腦切片的組織學分析未發現任何惡性轉化的證據。
脊髓損傷
脊髓損傷是由損傷脊髓并阻止大腦將命令傳遞給移動身體的神經的損傷或事故引起的，從而導致四肢癱瘓。2016 年的一項全球調查顯示，脊髓損傷的流行病例數超過 2000 萬。僅在那一年，全球就有大約 100 萬例新病例，而日本則超過 36,000 例。在許多情況下，患者只能坐在輪椅上。目前，沒有任何治療可以完全修復受損區域。
2019 年，Hideyuki Okano 小組開始了一項臨床研究，為亞急性（損傷后 1-2 周）脊髓損傷患者移植源自 HLA 同源 iPS 細胞的神經祖細胞。主要目標是確認移植細胞的安全性和有效性。產生神經祖細胞并冷凍保存。將冷凍的神經祖細胞解凍以進行最終制備并直接注射到脊髓的受傷區域（UMIN000035074）。這種移植有望使受傷的神經再生并恢復運動功能和感覺。移植后患者隨訪約一年。由于沒有進行人類白細胞抗原匹配，因此在移植后的前六個月內給予免疫抑制藥物?；颊咭苍谶M行康復治療。
心臟衰竭
缺血性心臟病是心力衰竭的主要病因，其發病機制是由于冠狀動脈閉塞引起的心肌組織慢性缺血導致功能性心肌細胞壞死。由于成熟的心肌細胞不能自我更新，缺血和壞死區域被纖維組織所取代。結果，局部室壁運動受損，心臟收縮力降低。
為了彌補減少，心臟擴張，對不受缺血直接影響的心肌造成壓力損傷，導致進一步纖維化。這種現象被稱為重塑并進一步惡化心臟功能。因此，補充功能性心肌細胞是減少心力衰竭進展的非常明智的方法。由于心肌細胞不具有增殖能力并且難以一次大量生成，因此在初始再生研究中使用了類似于心肌細胞的細胞。
具體而言，骨骼肌細胞、骨髓來源的單核細胞和間充質干細胞（MSCs）被認為是候選者，并進行了動物實驗和臨床試驗。由于骨骼肌細胞不是心肌細胞，因此預計它們會通過與宿主的心肌融合來支持收縮力，但它們也可以誘發心律失常。結果證明，MSCs 和骨髓細胞的效果更差。
自體骨骼肌成肌細胞片（HEARTSHEET?）是一種再生醫學產品，用于治療缺血性心臟病引起的嚴重心力衰竭。它由自體骨骼肌細胞制成，并自體移植到心臟表面。
治療機制包括不與宿主心肌融合的營養因子的旁分泌作用。在日本，HEARTSHEET? 已上市銷售，并在國家醫療保健系統下對表現出嚴重心力衰竭癥狀（紐約心臟協會 III 或 IV 級和左心室射血分數 [LVEF]
然而，由于自體移植的性質，每位患者的準備工作既昂貴又耗時。此外，HEARTSHEET? 的治療效果逐漸減弱。因此，需要一種可用于許多患者的現成產品。一種可能的解決方案是使用源自 iPS 細胞的心肌細胞和匹配的人類白細胞抗原類型進行細胞片療法，這種療法可以適應許多患者。具有更高和更長旁分泌作用的細胞片也可以提高治療效果。
在動物實驗中，與之前移植的非心肌細胞不同，源自人類 ES 細胞的心肌細胞在組織學上和電學上與宿主心肌（豚鼠）結合。對猴子的研究也顯示了活力和功能的改善，表明可能的治療效果。在心肌梗塞的猴子模型中，觀察到 HLA 匹配的猴 iPS 細胞衍生的心肌細胞在移植后 12 周仍具有活力，并產生了宿主心臟的功能改善。然而，在所有猴子中都觀察到了一些室性心律失常，這表明有必要對移植的致心律失常影響進行管理。
在日本，HEARTSHEET? 的開發者之一 Yoshiki Sawa 小組從 iPS 細胞中生成了心肌細胞片，用于治療豬的心力衰竭。然后，他們檢查了改善心臟功能的機制，包括分析 iPS 細胞衍生的心肌細胞中的旁分泌因子。
此外，通過使用HLA-homo iPS細胞原液，并改進試劑和制造方法，他們成功地生成了大量可移植到人體的高度安全的心肌細胞片。他們現在正在進行一項臨床試驗，以驗證床單的安全性和有效性（jRCT2053190081）。
該試驗是為缺血性心肌病患者設計的，預計有 10 名患者。Jun Yamashita 和 Hidetoshi Masumoto 小組開發了一種技術，通過該技術將心肌細胞、內皮細胞和周細胞混合、形成薄片并使用明膠 (IHJ-301) 分層。
由于分層可大量促進移植細胞的長期存活，因此與單片相比，這些多層片有望獲得更強和更持久的治療效果。他們在動物模型中評估了治療的安全性和有效性。
目前，他們正計劃開展一項臨床試驗，通過移植人 iPS 細胞衍生的多層心臟組織片結合手術治療或作為單一療法來評估心臟再生治療的安全性和有效性。
心肌片應通過分泌營養因子改善心肌血流，促進心肌再生。另一方面，Keiichi Fukuda 小組正在研究通過將 iPS 細胞衍生的心室肌球 (Heartseed?) 直接移植到患者的心肌 (jRCTa032200189) 來改善心跳的方法。臨床試驗計劃于 2021 年開始。他們計劃將肌肉球體移植到三名患者身上，以確認培養心肌細胞和改善心臟收縮功能的安全性和有效性。
血小板減少癥
日本每年消耗來自超過 170 萬升獻血的血小板制劑。血小板制劑只能在采血后儲存四天。此外，由于少子化和人口老齡化，獻血者的數量正在減少，但需要醫療服務的老年人數量正在增加。因此，未來不僅血小板制劑，輸血制劑也可能供不應求。
如果由于再生障礙性貧血或其他疾病導致嚴重的血小板減少癥，則進行血小板輸注。但是，可能會出現血小板輸注難治性，即輸血后血液中的血小板計數不升高。造成這種情況的原因包括輸注的血小板被識別為外來的并被患者自身的免疫細胞破壞。在這種情況下，血小板不能通過同種異體血小板輸注來補充。但是，如果血小板是由患者自身的細胞制成的，則輸血應該可以防止免疫反應。
Koji Eto 小組已成功使用生物反應器裝置從 iPS 細胞中生成大量血小板 ，并正在對伴有血小板輸注難治性的再生障礙性貧血患者自體輸注 iPS 細胞來源的血小板進行臨床研究 (jRCTa050190117)。
該患者試驗的目的是測試所用血小板產品的安全性。研究設計是一項單中心、開放標簽、非對照研究/單劑量遞增研究，輸血后隨訪一年。血小板輸注的過程始于從患者身上采集細胞并產生 iPS 細胞。
然后，從 iPS 細胞產生巨核細胞并作為主細胞庫冷凍。將這些主細胞解凍，在培養基中培養巨核細胞后，進行血小板生成。在血小板被分離、濃縮和洗滌后，殘留的巨核細胞在輸血前通過照射根除。主要終點是安全性，次要終點是療效（血小板增加）。
癌癥免疫療法
最近，癌癥免疫療法作為繼手術治療、化學療法（抗癌藥物和激素給藥）和放射療法之后的一種治療選擇而受到關注。CD1d 限制性不變自然殺傷 T (iNKT) 細胞是表達單個 T 細胞受體（人類中的 Vα24-Jα18 和 Vβ11 鏈以及小鼠中的 Vα14-Jα18 和 Vβ8.2 鏈）并通過識別呈遞的糖脂抗原而被激活的淋巴細胞在 CD1d 上，一種 MHC I 類分子。
活化的iNKT細胞通過產生穿孔素等細胞毒分子表現出直接的細胞毒活性，同時也產生大量的細胞因子如IFNγ，誘導NK細胞和CD8+T細胞活化，從而發揮抗腫瘤作用。作為頭頸癌的新療法，Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 小組正在使用 iPS 細胞衍生的 NKT 細胞進行臨床試驗?(jRCT2033200116)。
關節軟骨損傷
骨關節炎是全世界最普遍的關節疾病，影響 60 歲以上的估計 10% 的男性和 18% 的女性。關節軟骨具有獨特而光滑的結構，使我們能夠平穩無痛地移動關節。受損的關節軟骨在移動關節時會引起疼痛。Noriyuki Tsumaki 小組已開始一項通過 HLA 同源 iPS 細胞原種來源的軟骨移植（jRCTa050190104）再生關節軟骨損傷的臨床試驗。
在這項臨床研究中，移植僅在一個膝蓋上進行，包括四名符合標準的患者（20 至 70 歲，軟骨損傷區域有限）。該手術使用關節鏡來移植軟骨組織。術后患者康復6周，軟骨再生修復隨訪1年。該小組已經成功地從人類 iPS 細胞中生成了高質量的軟骨。先前的動物研究證實，iPS 細胞衍生的軟骨不會產生腫瘤，而是在移植區域再生軟骨。
臨床研究的目的是評估軟骨損傷患者將軟骨植入膝關節損傷區域的安全性。主要終點是不良事件的頻率和腫瘤發生的存在。為了制備軟骨，從 HLA 同源 iPS 細胞原液中誘導軟骨細胞，并從軟骨細胞中產生軟骨組織。研究人員的目標是在未來通過這種治療來治療膝關節骨關節炎。
尿素循環障礙
尿素循環是肝臟中將有毒氨 (NH3) 轉化為無毒尿素的途徑。尿素循環障礙是由于先天性尿素合成途徑代謝異常，導致高氨血癥而引起的一組疾病。飲食和藥物/氨基酸療法是基本療法。
在急性期，給予靜脈輸液、中心靜脈營養和血液透析。飲食療法限制了蛋白質的攝入量，但應適當進行，以免引起營養障礙。藥物包括苯甲酸鈉和苯丁酸鈉，可從體內排出氨。氨基酸療法包括精氨酸和瓜氨酸。
對于高氨血癥發作控制不佳的患者，肝移植是唯一的治療方法。盡管希望盡早進行肝移植，但由于存在嚴重術后并發癥的風險，新生兒的肝移植必須等到體重約 6 kg 時進行。
然而，在等待患者成長的三到五個月內，即使進行其他治療，也可能發生陣發性嚴重高氨血癥，導致嚴重的腦損傷或死亡。因此，即使最終進行了肝移植，對大腦的損害也是不可逆轉的，因此需要在肝移植之前進行“過渡治療”。
在日本，無法獲得腦死亡肝移植供體的肝細胞，該疾病面臨的最大挑戰是確保穩定供應質量一致的肝細胞作為肝細胞移植的細胞來源。因此，Akihiro Umezawa 小組專注于制備人 ES 細胞來源的肝細胞（JMA-IIA00412）。
通過創建人類 ES 細胞衍生肝細胞的冷凍保存儲備，他們能夠適應緊急使用。他們在 2 天內向一名確診為嚴重尿素循環障礙（I 型瓜氨酸血癥）的新生兒施用了 1.9 億個人類 ES 細胞衍生的肝細胞。
給藥完成，沒有任何與移植過程相關的并發癥或不良事件?；颊哌M展順利，以父親為供體接受了活體肝移植。在針對排斥進行強化免疫抑制治療后，患者情況好轉，并在 6 個月大時出院，沒有進一步的并發癥。
這一成就是肝功能衰竭患者的潛在過渡療法。我們的研究小組還致力于利用人類 iPS 細胞衍生的肝細胞作為橋接療法來實現肝功能衰竭患者的再生醫學。
腎臟疾病
根據一項全球調查，2017 年約有 7 億患者患有慢性腎臟病 (CKD)，這意味著全球患病率約為 9%，約有 120 萬人死于 CKD。在日本，有超過 330,000 名透析患者，其中約 7000 人已接受透析超過 30 年。腎
移植是一種恢復腎功能的治療方法，也是終末期腎功能衰竭患者透析的替代方法。腎移植有兩種主要類型，尸體腎移植和活體腎移植。在日本，腦死亡供體的腎移植不如其他國家先進。
此外，由于倫理問題以外的各種原因，目前日本的腎移植數量僅限于每年約 1700 例。與美國每年進行的 20,000 多例腎移植相比，這是一個非常小的數字。
因此，腎病的再生醫學備受期待。我們的研究小組旨在利用源自 HLA 同源 iPS 細胞的腎單位祖細胞 (NPC) 開發 CKD 和急性腎損傷 (AKI) 的細胞療法。
NPC 是構成腎單位的上皮細胞的來源，并通過來自稱為輸尿管芽的集合管祖組織的分化誘導刺激形成腎小球和腎小管。腎臟被一層薄的膠囊覆蓋，iPS 細胞衍生的 NPC 給藥到腎實質和膠囊之間的空間對缺血再灌注損傷誘導的 AKI 小鼠模型顯示出治療效果（圖 3A，B）。我們假設這些 NPC 提供多種營養因子來為衰竭的腎臟提供能量，并且它們會產生直接和局部的旁分泌效應。我們目前正在開發純化 NPC、確保其質量并大量生產用于人類治療的方法（圖 3C）。
圖3：使用腎單位祖細胞治療腎臟疾病的細胞療法。(A) 急性腎損傷 (AKI) 小鼠模型在接受生理鹽水注射 (圓圈) 或未分化的 iPS 細胞（hiPSC，正方形）或 hiPSC 衍生的腎單位祖細胞 (NPC) 樣腎祖細胞（hiPSC-NPC，三角形）的腎包膜下移植。***，與生理鹽水相比，P
先天性聽力損失
Pendred 綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，以感音神經性耳聾、甲狀腺腫和碘化物組織受損為特征。它占遺傳性聽力損失的 10%，是由 SLC26A4 基因突變引起的。基因修飾小鼠不會出現患者出現的進行性耳聾，因此很難使用動物疾病模型開發治療藥物。
Okano 和 Kaoru Ogawa 小組表明，患者 iPS 細胞來源的內耳細胞比來自健康供體來源的 iPS 細胞的內耳細胞更容易死亡。此外，他們發現 mTOR 抑制劑西羅莫司僅能以臨床使用劑量的 1/10 改善體外細胞應激的易感性。
基于這些結果，估計給 Pendred 綜合征患者服用小劑量西羅莫司（西羅莫司小劑量治療）可以通過抑制細胞死亡來改善內耳細胞的脆弱性并減緩疾病的進展，從而減少聽力損失和眩暈發作。他們于 2018 年開始了一項由醫生主導的臨床試驗，以確認低劑量西羅莫司制劑的安全性及其對聽力損失和眩暈發作（內耳疾病的急性加重癥狀）的療效（UMIN000033083）。
難治性骨和軟骨疾病
使用患者 iPS 細胞對肌肉骨骼疾病的研究取得了很大進展。在闡明不同肌肉骨骼疾病發病機制的過程中，Tsumaki 組發現他汀類藥物可以改善成纖維細胞生長因子受體 3 (FGFR3) 突變相關的軟骨發育不全和致死性發育不良 ，而 Makoto Ikeya 和 Junya Toguchida 組成功地鑒定可改善進行性骨化疾?。ㄟM行性骨化纖維發育不良（FOP））病理學的化合物，這導致了臨床試驗。
FOP 是一種罕見疾病，在日本僅影響 200 萬人中的 1 人和約 80 名患者。眾所周知，FOP 的原因是骨形態發生蛋白 (BMP) 受體 ACVR1 中的氨基酸取代突變。然而，突變受體傳遞骨化信號的機制仍未解決，也沒有有效的治療方法。
Ikeya 和 Toguchida 小組使用患者 iPS 細胞證明，激活素 A 對 BMP 信號傳導的異常激活是 FOP 異位骨化的原因。通過使用激活素 A 和 FOP 患者來源的 iPS 細胞對約 7000 種化合物進行高通量篩選，他們發現 mTOR 信號傳導的激活導致異位骨化，并將 ENPP2 鑒定為將 ACVR1 突變與 mTOR 信號傳導聯系起來的分子。
這些結果表明，激活素 A、ACVR1、ENPP2 和 mTOR 通路是 FOP 異位骨化的主要因素。此外，他們將西羅莫司確定為抑制異位骨化的候選藥物。2017年，他們開始了一項臨床試驗，通過多中心隨機雙盲安慰劑對照比較試驗和開放標簽連續給藥試驗（UMIN000028429）來研究西羅莫司治療FOP的療效和安全性。
結束語和未來方向
使用 iPS 細胞的臨床醫學已經安全有效地發展。在這篇綜述中，我們概述了日本使用 iPS 細胞進行的臨床試驗，并解釋了基因編輯的低抗原性 iPS 細胞如何有可能解決細胞療法中的許多免疫問題。此外，這些 iPS 細胞可以作為單批細胞產品的來源，以治療患者中更廣泛分布的人類白細胞抗原類型，從而降低每劑治療的成本。隨著它們逃避免疫的風險增加，細胞致瘤性研究也需要在各種細胞和應用上進行驗證。
隨著低抗原性 iPS 細胞系和來自個體患者的 iPS 細胞系的建立，細胞療法有望擴展到多種疾病。此外，開發從 iPS 細胞產生功能成熟的細胞或組織和人體大小器官的方法將有助于新的再生療法和更合適的疾病模型。未來幾年將看到基于 iPS 細胞技術的再生醫學的進一步普及。
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