腫瘤新抗原的鑒定流程

主要組織相容性復合體 I（major histocompatibility complex class I，MHC I）在免疫反應中起重要作用。人類的MHC也被稱為人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）。MHC I能夠結合，并在細胞膜表面呈遞一個由8-15個氨基酸組成的肽段，這個被呈遞的肽段作為一個信號，會被T細胞表面的受體（T-cell receptor，TCR）識別，并引發一系列生化反應，從而激活T細胞，產生免疫應答反應。

腫瘤細胞表面的MHC I能夠呈遞具有高度特異性的肽段，稱為腫瘤新抗原（neoantigen）。由于其在正常細胞中并不表達，因此這類肽段是腫瘤免疫治療和腫瘤疫苗的理想靶點。近年來，以腫瘤新抗原為基礎的免疫療法受到了極大的關注，但是從細胞膜表面準確地鑒定到腫瘤特異的新抗原依然是一項難度不小的挑戰。

傳統的腫瘤新抗原鑒定方法是采用基因組或轉錄組測序技術，從DNA或者mRNA上鑒定腫瘤特異的突變（多為點突變），而后僅通過軟件預測，產生出有可能成為腫瘤特異的新抗原的候選肽段。具體的流程見下圖。

1）嚴重依賴于基因組或轉錄組測序的結果，但基因組或者轉庫組測序技術并不能直接分析出肽段是否是在細胞膜表面被呈遞的；

2）嚴重依賴于預測軟件，但這些軟件的準確性尚無明確定論；

3）只能分析出由正?；蚣盎蛲蛔儺a生的肽段，對其他來源產生的新抗原無能為力。

為了解決上述問題，我們快序生物開發了基于質譜儀的腫瘤新抗原的全新鑒定流程。我們采用弱酸洗脫（mild acid elution，MAE）和免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）兩種方法提取與MHC I結合的肽段（客戶可以根據樣本的實際情況選擇最合適的方法），而后我們將富集得到的肽段通過高分辨、高靈敏度的質譜儀檢測，從而得到高質量的質譜數據。之后，通過我們獨有的肽段從頭測序（de novo sequencing）軟件進行分析，得出新抗原的候選肽段。我們的從頭測序技術平臺不僅能夠鑒定到蛋白質數據庫中已知的肽段，同時對于蛋白質數據庫中并未標注的新肽段，比如帶有點突變的新肽段、由其他肽段拼接而成的新肽段等，我們也都能夠鑒定到。我們開發的腫瘤新抗原的全新鑒定流程，大大提高了新抗原的鑒定率，并能夠為客戶提供盡可能多的候選肽段。具體的流程見下圖。

1）更直接，不依賴于基因組或轉錄組測序技術。我們的腫瘤新抗原質譜鑒定技術利用肽段從頭測序技術平臺對LC-MS得出的數據直接進行分析，整個過程無需進行基因組測序；

2）更準確，不依賴于預測軟件。我們的腫瘤新抗原質譜鑒定技術直接從細胞中提取與MHC I結合的肽段，并通過質譜儀對它們進行分析，從而直接鑒定在細胞膜表面被呈遞的肽段。通過這種方法測得的數據更接近于細胞中真實的生理狀態；

3）更多樣，能夠鑒定到多種不同來源的突變肽段。我們獨有的肽段從頭測序技術能夠鑒定到由于蛋白酶體或剪接體功能缺陷而產生的異常拼接的肽段，發生翻譯后修飾的肽段，由非正常的蛋白質翻譯產生的肽段（比如基因被移框翻譯，或基因的非編碼區或內含子被翻譯），同時也可以鑒定到由于mRNA被進一步編輯而產生的肽段等；

4）更多選擇，根據樣本類型提供最優的肽段提取方式：弱酸洗脫（MAE）提取肽段的過程無需破碎細胞，實驗步驟較少，樣本損失較少，適合細胞數量較少的新鮮細胞；免疫沉淀（IP）富集得到的肽段特異性更強，得到的肽段數目也更多，但實驗步驟較多，需要的細胞數量也較多，適用于冷凍細胞和實體腫瘤樣本。