下一代CAR-T細胞治療的CAR設計

介紹

嵌合抗原受體(CAR)是合成受體，使T細胞能夠以主要組織相容性復合體(MHC)非依賴性方式識別腫瘤相關抗原(TAA)。靶向泛B細胞標記物CD19的CAR-T細胞在治療難治性B細胞惡性腫瘤方面顯示出前所未有的反應率，并成為第一個基于基因修飾的細胞療法來治療難治性B細胞惡性腫瘤。獲得美國食品和藥物管理局的批準。

然而，針對非 B細胞惡性腫瘤的有效CAR-T細胞療法的開發需要更復雜的工程方法來克服腫瘤防御機制，例如免疫抑制、抗原逃逸和進入實體瘤的物理障礙。

在這篇綜述中，我們研究了當前和未來的CAR設計策略、表達CAR或腫瘤特異性T細胞受體(TCR)的T細胞，以及工程T細胞與腫瘤微環境(TME)之間的相互作用，特別關注改善過繼性T細胞療法治療實體瘤的有效性和安全性（圖 1）。

圖 1. CAR-T細胞工程方法。設計CAR-T細胞以改善實體瘤功能的策略包括關注CAR工程、T細胞工程和TME相互作用優化。

設計 CAR 蛋白

CAR設計的演變

桑名等(1987) 通過將 TCR恒定區與細菌抗原識別抗體的可變區融合，首次證明了將抗體類型抗原特異性與T細胞信號傳導相結合的原理。單鏈可變片段 (scFvs) 由單克隆抗體 (mAb) 的可變重 (VH) 鏈和輕 (VL) 鏈組成，由柔性接頭隔開，仍然常用作 CAR 的細胞外抗原感應域。腫瘤靶向CAR的第一份報告表明，scFv識別抗原，例如與CD3ζ信號結構域融合的人表皮生長因子受體2 (HER2) 可以引發腫瘤特異性細胞毒性，但表達這些“第一代”CAR的T細胞通常無法引發有效的抗腫瘤作用，這些 CAR 僅包含用于 T 細胞信號傳導的 CD3ζ 鏈。

在接下來的幾年里，第二代和第三代 CAR 出現了，它們分別包含一個或兩個共刺激域，這源于生物學上的理解，即內源性 TCR 需要與其他共刺激或輔助分子結合以實現強大的信號傳導。這些共刺激結構域最常源自CD28或4-1BB，賦予更有效的抗腫瘤細胞毒性、增加細胞因子的產生以及改善CAR-T細胞的增殖和持久性。共刺激域的選擇對廣泛的特性有影響，包括代謝途徑、T 細胞記憶發展和抗原-獨立的強直信號，促使進一步研究其他共刺激域。例如，具有OX40和CD28共刺激結構域的第三代CAR抑制了CD28誘導的白細胞介素 (IL)-10 分泌，這是一種損害 T 細胞活性的抗炎細胞因子。此外，誘導性 T 細胞共刺激 (ICOS) 共刺激結構域與CD28或 4-1BB 共刺激相結合增加了體內持久性，而 MyD88/CD40共刺激改善了CAR-T細胞的體內增殖。

最近，已經報道了包含額外刺激域的第四代CAR，通常稱為“裝甲”CAR。在一個例子中，Chmielewski 等人(2014)工程化的裝甲CAR-T細胞被稱為“T 細胞重定向用于通用細胞因子介導的殺傷”(TRUCK)以分泌促炎細胞因IL-12以刺激先天免疫細胞對抗腫瘤并抵抗 TME 的抑制元素，包括調節T (Treg) 細胞和髓源性抑制細胞 (MDSC)。已經研究了其他可溶性因子的分泌，包括IL-15或IL-18以增強T細胞增殖，以及CCL19和IL-7 的組合以募集內源性免疫細胞并建立針對腫瘤的記憶反應。

除了上面概述的CAR設計的演變之外，CAR的四個主要組成部分：細胞外抗原感應域、細胞外鉸鏈或間隔區、跨膜域和細胞內信號域的模塊化已經能夠進一步優化這些中的每一個提高CAR-T細胞療法療效的成分。這些工程工作在其他評論中得到了很好的總結。在這里，我們將注意力集中在使T細胞能夠擴展到由傳統CAR設計編程的硬連線、單輸入、單輸出信號能力之外的策略（圖 2）。

圖 2. 提高CAR-T細胞可編程性、安全性和功效的蛋白質工程策略

(A) AND和AND-NOT邏輯分別使用SynNotch受體和iCAR進行組合抗原識別，可以提高抗原特異性和安全性。串聯雙特異性OR門CAR可以避免抗原逃逸并提高療效。

(B) 設計的ON和OFF開關可以輕松有效地改變CAR-T細胞活性。

(C) 將CAR編程為僅在存在適配器或通過亮氨酸拉鏈介導的重構時激活可以增加對CAR-T 細胞活性的可控性。

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用于邏輯門控T細胞激活的組合抗原感應

布爾邏輯門已被用于 AR-T細胞對多種抗原的組合檢測，以提高其安全性和抗腫瘤功效（圖 2A）。AND門邏輯需要同時存在兩種不同的抗原來激活CAR-T細胞，而這種增加的規范降低了脫靶識別或“脫靶、脫瘤”毒性的風險，其中表達與腫瘤細胞相同的抗原遭受附帶損害。合成的Notch (synNotch) 受體——在識別細胞表面結合的配體時觸發可誘導的靶基因表達——被設計成識別TAA并誘導CAR的表達，隨后在識別一個第二個TAA。與組成型CAR表達相比，這種策略已被證明可以降低全身毒性，前提是腫瘤外靶標在空間上不靠近腫瘤細胞。由于synNotch對TAA #1 的識別與CAR對 TAA #2 的識別之間存在時間延遲，因此給定的 T 細胞可能具有由來自腫瘤細胞的 TAA #1 觸發的 SynNotch 受體，但隨后會攻擊表達TAA #2。

另一種與門方法將CD3ζ鏈和共刺激結構域分成兩個組成型表達的受體，每個受體識別不同的抗原，這樣CAR-T細胞只有在兩種抗原同時存在時才能最佳激活。然而，由于僅包含CD3ζ鏈的第一代CAR已經具有信號能力，因此這種方法通常會受到“泄漏”的影響。另一種策略是在CAR或TCR介導的細胞表面TAA #1檢測后，對T細胞進行編程，以提供有條件活性的細胞毒性蛋白；當且僅當它在靶細胞內檢測到TAA #2時，工程蛋白才會變得具有細胞毒性，因此需要由同一靶細胞表達兩種抗原以觸發強力殺傷。

被編程為執行AND-NOT邏輯的CAR-T細胞也有助于防止對健康細胞的毒性。該策略利用了一種抑制性CAR (iCAR)，它以健康組織上發現的抗原為目標，并將其與以TAA為目標的激活CAR配對。在一項原理驗證研究中，結合程序性細胞死亡蛋白 1 (PD-1) 抑制信號域的前列腺特異性膜抗原(PSMA)靶向iCAR與第二代CD19 CAR共表達，而iCAR在PSMA 存在下抑制CAR-T細胞活化。

雖然AND和AND-NOT邏輯可以通過增加特異性來提高CAR-T細胞的安全性，但OR 門邏輯已被用來通過規避抗原逃逸或腫瘤細胞丟失靶向表位來提高抗腫瘤功效。OR-gate CAR可以識別兩種不同的TAA，并且任一抗原的結合都會誘導T細胞活化。一種OR門策略利用兩個CAR-T細胞群 (CAR pool) 的混合混合物，每個細胞群表達一個單特異性CAR。該主題的一個變體是順序管理兩種不同的CAR-T細胞產品。

另一種策略是在每個 T 細胞中共表達兩個單獨的 AR（雙CAR）。另一種方法使用串聯雙特異性CAR (TanCAR)，它包含由一個受體鏈上的接頭分隔的兩個scFv結構域，并且該策略被證明在功能上優于 CARpool和雙CAR方法（Hegde等人，2016 年；Zah 等人，2020 年）。特別是，CD19/CD20 和 CD19/CD22雙特異性CAR已被表征用于治療B細胞惡性腫瘤并且正在進行臨床試驗分別用于淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病（NCT04007029、NCT04215016、NCT03919526、NCT04303520）。

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用于可控性和安全性的ON/OFF開關

用于提高安全性和可控性的CAR修改也采用了外部誘導或自調節ON/OFF開關的形式。傳統的 CAR-T 細胞“永遠在線”，這意味著它們的 CAR 是組成型表達的，并且總是能夠在抗原刺激時發出信號。然而，當CAR衍生的毒性是預期風險時，這并不總是可取的。除了之前討論的脫靶和“在靶、脫瘤”毒性外，在接受 CAR-T 細胞治療的患者中也觀察到了各種全身毒性。常見的例子包括細胞因子釋放綜合征(CRS)、神經毒性或“CAR 相關腦病綜合征”（CRES），腫瘤溶解綜合征和過敏反應（Maus等，2013）。據推測，在空間和時間上調節CAR-T細胞活性可以預防或顯著減輕與CAR-T細胞療法相關的毒性的嚴重程度，同時保持其抗腫瘤功效。

調節CAR-T細胞活性的一種方法是通過調節CAR蛋白本身的穩定性或構象來調節工程化 T 細胞表面上功能性CAR的存在（圖 2B）。作為前一種策略的例子，CAR已與降解標簽融合，這些標簽可以通過小分子結合或在缺氧條件下滅活。此類系統的默認狀態為“關閉”，需要去除或滅活降解標簽以穩定CAR 蛋白，從而在抗原刺激下激活CAR介導的 T 細胞。還證明了另一種設計，其中CAR蛋白默認存在，但通過小分子藥物的給藥關閉。

除了調節蛋白質半衰期，控制CAR蛋白的構象還可以調節功能性CAR的可用性，這樣受體僅在特定條件下才具有信號傳導能力。例如，CAR的抗原結合域可以被內置的抑制肽“掩蓋”，這樣CAR的功能構象只有在抑制肽被TME中通常有活性的蛋白酶切割后才能獲得。

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依賴于適配器的CAR

或者，T細胞可以被設計為表達一種受體，在得到的復合物能夠將抗原識別轉化為T細胞活化之前，必須由額外的蛋白質成分補充該受體（圖 2C）。

Urbanska等人報道了一種“通用”受體，包括與細胞內T細胞信號傳導域融合的生物素結合域。原則上，表達這種生物素特異性受體的T細胞可以針對任何已用生物素化抗體標記的靶細胞。這種策略的兩個優點包括：(1)通過給予或抑制生物素化抗體控制T細胞的ON/OFF狀態和 (2) 使用相同的生物素特異性受體通過改變TAAs來靶向多種TAA。生物素化抗體的特異性。使用通用 CAR 與一種或多種抗原靶向接頭蛋白結合以克服腫瘤異質性并減輕毒性的概念很快為其他依賴接頭的CAR設計打開了閘門，包括一個小分子接頭，它與異硫氰酸熒光素 (FITC) 和葉酸，可減輕 NSG 小鼠模型中 CRS 樣毒性。

Cho等人擴展了在 T 細胞表面組成性表達通用受體與外部施用的銜接蛋白結合以決定抗原特異性的概念，報道了一種SUPRA CAR系統，該系統可以通過表達多個堿基受體對工程化 T 細胞中的各種布爾邏輯門進行編程，每個堿基受體都有多個潛在的接頭蛋白伴侶，通過亮氨酸拉鏈二聚化重組。這樣的系統支持通過使用AND或AND-NOT門同時增加特異性的可能性，同時通過用不同的銜接蛋白靶向多個抗原來解決腫瘤異質性。然而，多組分系統的多功能性以必須優化的參數數量增加為代價，包括半衰期、生物分布和銜接蛋白、堿基受體和工程 T 細胞本身之間的相互作用動力學。因此，通過依賴于適配器的 CAR 設計可實現的復雜信號處理是否會轉化為強大的治療候選者還有待觀察。

參考文獻DOI:10.1016/j.ccell.2020.07.005