CAR-NK細胞在癌癥免疫治療中的應用

介紹

最近的臨床前和臨床研究支持了這樣一種觀點，即CAR-NK細胞療法可以在人類血液學和實體惡性腫瘤中發揮預期的效果，這意味著它們具有廣泛的臨床應用。在這里，我們將強調開發CAR-NK 細胞療法作為癌癥免疫療法背景下的一種創新策略，并簡要概述了CAR-NK細胞療法在人類惡性腫瘤中的最新發現，重點是臨床前研究。

NK細胞介導的癌癥免疫監測

NK細胞對癌細胞的鑒定是一個嚴格控制的過程，包括癌細胞上的特定配體與NK細胞受體的通信，并在效應NK細胞中引發來自這些受體的信號。NK細胞可以直接消除癌細胞主要依賴于穿孔素，正如在各種實驗模型系統中廣泛證明的那樣。

盡管如此，NK 細胞也可以通過死亡受體介導的軸根除腫瘤細胞，包括腫瘤壞死因子(TNF) 相關的凋亡誘導配體(TRAIL)和Fas配體 (FasL)。

此外，效應NK細胞分泌各種細胞因子和趨化因子，觸發其他先天性和適應性免疫細胞反應。

癌癥中的NK細胞功能障礙

腫瘤細胞、腫瘤相關成纖維細胞(TAF)、巨噬細胞、樹突細胞 (DC)、T細胞和其他類型的細胞可以產生免疫抑制分子或促進無數受體的表達，從而促進活化和抗腫瘤NK細胞的功能；然而，使用 CAR-NK 細胞可以消除這種抑制作用（圖 1）。

圖1 腫瘤微環境 (TME) 中的 NK 細胞功能障礙。

調節性T細胞（Treg 細胞）和髓源性抑制細胞（MDSC）可以通過各種機制抑制NK細胞的活化。相應地，MDSCs可以塑造腫瘤容許環境，還通過負調控NK細胞影響腫瘤的發生、血管生成和發展。癌癥患者的 MDSCs可以抑制 NK細胞Fc受體(FcR)介導的活動，包括抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放和信號轉導。

此外，在腫瘤進展過程中，活化NK細胞受體如自然殺傷蛋白30 (NKp30)、NKG2D 和CD16的表達降低；而抑制性受體如NKG2A的表達增加。NKG2A可以有力地消除NK細胞活性，最顯著的是細胞毒性。盡管如此，NKp30的一些剪接可以起到抑制性受體的作用。相反，各種基質衍生因子如 TGF-β1參與腫瘤介導的NK細胞抑制。

癌細胞中的Toll樣受體4 (TLR4) 激活能夠分泌各種可溶性因子和蛋白質，包括IL-6、IL-12、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、B7-H1和B7-H2，從而導致癌細胞對CTL攻擊的抵抗力。同樣，在TLR4阻斷后，腫瘤細胞在體外和體內對NK細胞的抑制作用減弱，表明TLR信號傳導可以誘導級聯反應，維持腫瘤逃避免疫監視。

此外，逃避免疫監視可能是由于癌細胞表面上C-C趨化因子受體4 (CCR4)的更高表達。在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，腫瘤微環境中的CCR4表達使CCR4能夠與趨化因子CCL17和CCL22通信，這可能會改善Treg細胞向腫瘤部位的募集并隨后阻礙NK細胞功能。

有趣的是，研究表明，人肝臟腫瘤中浸潤腫瘤的NK細胞線粒體小而碎片化，而腫瘤外的NK細胞和外周NK細胞的線粒體正常，這表明腫瘤區域的NK細胞功能障礙可以由它們的表型障礙阻礙了相應的抗腫瘤功能。由于缺氧腫瘤微環境通常會誘導NK細胞中雷帕霉素-GTP酶動力相關蛋白1(mTOR-Drp1) 的機制靶標的激活，可能會發生線粒體斷裂。這可以通過mTOR-Drp1；阻斷后NK細胞的線粒體斷裂、存活和抗腫瘤能力的改善來證明。

最后，已發現惡性細胞（如膠質母細胞瘤細胞）產生可溶性乳酸脫氫酶 5 (LDH5)可誘導健康骨髓細胞表面的NKG2D配體。健康骨髓細胞表達NKG2D配體可能會阻止 NK細胞上NKG2D受體的激活，從而避免識別攜帶 NKG2D配體的腫瘤并改變抗腫瘤反應。

CAR結構

CAR是一種合成的混合抗原受體，通常由抗體的可變區和T細胞受體 (TCR) 的恒定區組成，使免疫細胞能夠選擇性地識別腫瘤細胞上表達的TAA。經典CAR具有信號肽、單鏈抗體可變片段(scFv)、跨膜(TM)和細胞內信號結構域。scFv源自腫瘤特異性抗體，可以與癌細胞上呈現的特定抗原相互作用表面，而細胞內信號結構域來自TCR或其他刺激受體的細胞質結構域的免疫受體酪氨酸激活基序 (ITAM)。

由于僅包含CD3ζ的第一代CAR無法在T細胞激活后有效刺激腫瘤根除，因此包含T細胞共刺激分子的第二代 CAR，包括CD28、4-1BB (CD137)、ICOS或OX40(CD134)和CD3ζ。

第三代 CAR設計和開發了包括3個信號域，例如CD3ζ和2個共刺激域。雖然沒有可靠的證據表明第三代CAR與第二代CAR相比性能有所增強，但有人認為含有 4-1BB共激活的 CAR 可以發揮更好的T細胞記憶特征，而 CD28 共激活激活引發了卓越的 T 細胞激活和擴增。

CAR構建體通常插入基于逆轉錄病毒或慢病毒的表達載體，隨后用于轉導原代NK細胞或NK細胞系，最常見的是NK-92，一種依賴于白細胞介素-2(IL-2)的NK細胞從外周血單核細胞 (PBMC) 中分離出的細胞系（圖 2）。

由于當前基于NK細胞免疫療法的試驗需要高 NK 細胞劑量和通常多次給藥，因此實現 NK細胞擴增的優化方案至關重要。此外，最近還建立了幾種復雜的NK細胞擴增方法。使用IL-2或IL-15或兩者進行 NK細胞擴增以產生1000倍擴增需要長達3個月的培養時間。然而，一種使用轉基因K562細胞的基于飼養細胞的NK擴增策略提供了大量2周擴增期后的K細胞。

圖2 CAR-NK細胞的產生過程。

血液系統惡性腫瘤中的CAR-NK細胞

白血病

由于NK細胞異常和白血病細胞的免疫抑制特性，惡性白血病細胞可以逃避NK細胞反應。已經發現，用抗CD33 CAR(CD33-CAR-NK-92)細胞改造的NK-92細胞在對CD33陽性白血病細胞的細胞毒性方面優于CAR-T細胞。此外，CD33-CAR- NK-92細胞對人AML細胞系HL-60表現出優于親本NK-92細胞的毒性，并且對于患有復發性和難治性AML的患者也是安全的。

在這方面，Salman等人發現CD4將 CAR-NK細胞注射到全身性 AML 植入的小鼠模型中，雖然體內持續時間較短，但可以強烈刺激抗白血病作用。

此外，一項針對FMS樣酪氨酸激酶 3（FLT3）特異性CAR-NK的研究B-ALL中FLT3常見過表達的細胞表明，注射重定向的 NK 細胞，而不是親本NK-92細胞，顯著消除了B-ALL NOD-SCID IL-2Rγnull小鼠模型中的疾病發展，從而表明B -ALL可以被FLT3-CAR-NK細胞成功靶向。

在NOD-SCID IL-2Rγnull小鼠的B細胞淋巴瘤(BCL)模型中，CD19-CAR-NK-92細胞阻礙了白血病的發展，表明生成具有有效和靶向抗腫瘤的CAR工程化NK-92細胞的可行性；同樣，來自成人外周血 (PB) 和臍帶血(UCB)的重定向NK細胞對CD19陽性白血病細胞的抗癌作用的研究表明，CD19-CAR-PB-NK細胞明顯更好在消除白血病細胞方面與CD19-CAR-UCB-NK細胞相比。

CD7-CAR-NK-92對T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)細胞系和T-ALL 異種移植小鼠模型具有選擇性和顯著的抗腫瘤活性，這可能是由更高水平的顆粒酶 B和IFN-γ，支持CAR-NK細胞療法也可有效治療T細胞相關疾病的觀點。

骨髓瘤和淋巴瘤

除了白血病，重定向的CAR-NK細胞還可以支持淋巴瘤和骨髓瘤的有利結果。相應地，CD19-CAR類記憶(ML)-NK細胞在體外對NK耐藥淋巴瘤細胞系表現出強大的抗腫瘤活性，這通過增加IFN-γ的產生、脫粒和選擇性裂解來證明。此外，從淋巴瘤患者身上建立的CD19-CAR ML-NK 細胞表現出對自體淋巴瘤的改善反應，并且還表現出減少的淋巴瘤負擔并提高了人類異種移植模型的總體存活率。

此外，針對CS1的CAR-NK細胞（CD319)是一種主要在多發性骨髓瘤 (MM)細胞上表達的表面蛋白，在體外改善了特定的CS1+MM細胞消除和IFN-γ分泌。它們還抑制了人類IM9 MM細胞的增殖，并在體內原位MM 異種移植小鼠模型中延長了總體存活率。?

同樣，檢查基于CD38特異性納米抗體的CAR（Nb-CAR的可能治療益處表明 Nb-CAR-NK-92 胞可以觸發對原代患者來源的CD38表達MM細胞的細胞毒性。此外，重定向細胞選擇性地殺死CD38陽性而不是CD38缺陷的腫瘤細胞，并且還熟練地耗盡了原代人類BM樣本中的CD38陽性MM細胞。

與MM類似，CAR-NK細胞在治療各種類型的非霍奇金淋巴瘤（NHL），如外周T細胞淋巴瘤（PTCL）方面顯示出有希望的結果。在這方面，研究表明CD4-CAR-NK-92細胞可以選擇性地裂解各種CD4+人 T 細胞白血病和淋巴瘤細胞系（例如，KARPAS-299和CCRF-CEM）以及離體患者樣本。更重要的是，CD4-CAR-NK-92細胞在體內有效地消除了KARPAS-299細胞并顯著延長了異種移植小鼠的存活率，突出了 CD4作為T細胞相關疾病的潛在TAA 的重要性。

在另一項研究中，由低親和力Fc受體CD16或高親和力Fc受體CD64組成的2個特定CAR，添加了CD8a胞外域、CD28 TM 域、2個共刺激域 CD28 和 4-1BB，以及構建了來自 CD3ζ的信號域并稱為CD16-BB-ζ和CD64-BB-ζ。然后，它們被用來建立表達相應 CAR 的 NK-92MI細胞，命名為NK-92MIhCD16和NK-92MIhCD64 細胞。值得注意的是，與單獨使用利妥昔單抗相比，NK-92MI hCD16和 NK-92M IhCD64細胞與利妥昔單抗聯合使用時，對表達CD20的 NHL 細胞均誘導更高的細胞毒性，從而暗示表達CAR的NK-92MI細胞是一種不依賴IL-2的細胞通過轉染從NK-92細胞系衍生的NK細胞系可以維持對常規抗癌單克隆抗體的臨床反應。

最近，使用 CD19-CAR CB-NK 細胞對11名患有復發性或難治性 CD19+癌癥（例如NHL和慢性淋巴細胞白血病[CLL]的患者進行了1 期和2期臨床試驗。根據觀察，CAR-NK細胞輸注與CAR-T細胞治療中常見的細胞因子釋放綜合征（CRS）、神經毒性或移植物抗宿主病（GVHD）的發生率無關。此外，大多數患者對 CAR-NK 細胞治療表現出反應；然而，要得出療效結論，進行進一步試驗至關重要。

實體瘤中的CAR-NK細胞

EGFR受體(EGFR)是一種眾所周知的酪氨酸激酶受體，并且仍然處于腫瘤靶向治療的前沿。此外，報告顯示，EGFR特異性CAR-NK-92細胞和原代NK細胞在暴露于乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468后在體外表現出顯著的細胞毒性和IFN-γ和 MCF-7，而 EGFR 特異性CAR-NK-92 與原代NK細胞相比顯示出更好的治療效果。在乳腺腫瘤的異種移植模型中，腫瘤內注射 EGFR-CAR-NK-92細胞或溶瘤單純皰疹病毒1(oHSV-1) 可阻止腫瘤發展，同時與EGFR-CAR-NK-92聯合治療細胞和oHSV-1，導致更明顯的腫瘤細胞消除和移植小鼠的存活時間延長。

此外，EGFR-CAR-NK-92細胞給藥導致乳腺癌細胞中的三陰性乳腺癌 (TNBC) 消退系來源的異種移植物(CLDX)和患者來源的異種移植物 (PDX) 小鼠模型。同樣，在原位膠質母細胞瘤(GB)異種移植物小鼠模型中，顱內注射EGFR-CAR-NK-92細胞有力地抑制了腫瘤的發展，從而延長了荷瘤小鼠的總體存活率，引入重定向NK細胞是治療GB的有效策略。其他研究表明，用趨化因子受體CXCR4對這些EGFR-CAR-NK細胞進行進一步的基因修飾，可以提高對基質細胞的趨化性l 衍生因子 1(SDF1)在體外產生U87-MG膠質母細胞瘤細胞，與EGFR-CAR-NK細胞治療相比，促進異種移植小鼠的存活。

相反，在90%的卵巢癌中過表達的葉酸受體α(αFR) 的特異性靶向，通過使用αFR特異性 CAR-NK-92細胞導致αFR+腫瘤細胞在體外和小鼠異種移植物中的選擇性裂解卵巢癌模型。此外，比較分析表明，第三代αFR-CAR-NK-92細胞在對αFR+腫瘤細胞的有效細胞毒性方面優于第一代和第二代CAR。

此外，間皮素特異性CAR-NK細胞可以選擇性地消除間皮素陽性卵巢癌細胞（OVCAR-3和SK-OV-3），而它們在體外對間皮素陰性細胞（SK-HEP-1無反應。更重要的是，重定向的NK細胞在皮下和腹膜內腫瘤模型中均能有效根除卵巢癌細胞，這表明除αFR外，間皮素可能是卵巢癌靶向治療的可行靶點。

最近，其他研究結果表明，趨化因子受體CXCR1和CAR的共表達可能提供一種創新策略，通過增強效應免疫細胞的腫瘤浸潤來提高NK細胞在人類卵巢腫瘤中的治療效果。例如，在異種移植模型中，施用經過基因修飾以表達CXCR1的NK細胞和靶向NKG2D配體的CAR證明了對體內腫瘤細胞的更好遷移。此外，CAR-NK細胞發揮的細胞毒性不受CXCR1轉基因表達的負面影響，并且所施用細胞的腫瘤運輸改善導致異種移植物中的抗腫瘤反應增強。

與親代NK細胞相比，神經節苷脂GD2特異性CAR-NK細胞對GD2+神經母細胞瘤(NB)細胞顯著誘導更高的細胞毒性。除了 GD2-CAR-NK 細胞顯著轉移到3D腫瘤球體中，導致生長速度降低，如活細胞成像分析所證明的那樣，GD2-CAR-NK治療抑制了小鼠的腫瘤發展。此外，進一步的分析表明，重新定向NK細胞和組蛋白去乙酰化酶抑制劑 (HDACi) 或程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性細胞死亡配體 1(PD-L1) 阻滯劑的聯合治療可能更有效地抗-癌癥功能。

CAR修飾的NK細胞目前被認為是肝細胞癌(HCC)治療的可靠免疫治療方式。因此，與GPC3+ HCC細胞共培養的glypican-3 (GPC3)特異性CAR-NK-92細胞引起顯著的體外細胞毒性和細胞因子釋放，并在高和低表達 GPC3的HCC異種移植物中刺激抗腫瘤作用水平，但在沒有GPC3表達的情況下則不然。相應地，在GPC3+ HCC異種移植物中，抑制腫瘤發展同時增強了腫瘤細胞凋亡。

關于TGF-β抑制NK細胞功能的能力，Wang等人通過基因工程改造 NK-92細胞以表達一種嵌合受體，該受體具有TGF-β II型受體胞外和跨膜結構域以及NKG2D的胞內結構域，稱為TN嵌合受體.他們發現，表達TN的NK-92細胞對TGF-β誘導的抑制信號傳導具有顯著的抵抗力，并且還在體外刺激了更高的殺傷能力和對HCC細胞的IFN-γ生成。

此外，表達TN的NK-92細胞承諾被轉移到表達 TGF-β的惡性腫瘤中，并在HCC異種移植鼠模型中抑制腫瘤進展，表明TN嵌合受體可用于提高NK細胞過繼治療的抗腫瘤功效。

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結論與展望

基于集體證據，基于CAR-NK細胞的癌癥治療已成為一個令人鼓舞的先進研究領域。因此，已經進行了廣泛的動物研究（表 1），并且正在完成多項臨床試驗（表 2），以評估 CAR-NK 細胞在人類癌癥中的臨床安全性和有效性。然而，需要進行大規模的臨床研究來解決 CAR-NK 細胞在人類惡性腫瘤（如白血病、骨髓瘤和淋巴瘤）以及實體瘤中應用的可行性、安全性和有效性。值得注意的是，與CAR-T細胞相比，基于CAR-NK細胞的免疫療法不太可能發生CRS和神經毒性，這主要是因為活化的 NK 細胞主要分泌IFN-γ和 GM-CSF，而CAR-T細胞主要刺激細胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-10 和 IL-15，它們通常支持 CRS 和嚴重的神經毒性。10此外，即使使用同種異體 NK，GVHD 發生的風險也會降低細胞可能允許從多種來源建立 CAR-NK 細胞，例如 NK92 細胞系、PBMC、UCB 以及多能干細胞。

盡管NK細胞免疫治療取得了很大進展，但臨床療效仍然有限由于 NK 細胞在體內的短壽命和低細胞毒性，突出了尋找克服這一挑戰的新方法的重要性。然而，由于循環中CAR-NK細胞的壽命有限，因此對正常組織的靶向/非腫瘤毒性風險相對較低。

表1 CAR-NK細胞治療人類癌癥（體外和體內報告）

表2 CAR-NK細胞療法在ClinicalTrials.gov注冊的癌癥臨床試驗（2021年3月）

？？？NK還是按kg來算劑量么？對通用性細胞產品來說，是個大麻煩。

參考文獻DOI:10.1111/cas.14993