免疫細胞工藝生產設備匯總 下篇

接上文

?

5. T細胞擴增

為獲得臨床應用所需的細胞數量的T細胞擴增可以有多種方法，包括T瓶，平板或培養袋以及生物反應器，例如G-Rex燒瓶（Wilson Wolf），WAVE波浪式生物反應器（Cytiva）。最近的統計表明，有43％的CAR-T細胞臨床試驗使用波浪式生物反應器，而使用靜態培養袋的為35％，使用T瓶的為22％。

T型燒瓶不適合大規模工作，因為操作繁瑣，并且需要在安全柜中進行多個開放式處理步驟。靜態培養袋可以通過無菌管焊接在一起，并提供半封閉培養系統，但是培養基交換是手動過程，不易擴展。生物反應器具有幾個優點：G-Rex燒瓶是具有優化的氣體交換和采樣選項的封閉系統圓柱形容器，可在培養箱中快速擴增細胞。

思拓凡Cytiva波浪式生物反應器Xuri W25

市場占有率達到90%左右。波浪式生物反應器采用非介入的波浪式搖動混合，避免了攪拌漿葉端和鼓泡對細胞的傷害，提供溫和低剪切力高溶氧的細胞培養微環境。和靜置培養袋相比，波浪式生物反應器培養體系最高可達25L，適應不同階段或規模的細胞培養；灌流實現高密度細胞培養；內置的質量流量、氣體混合和輸出及在線監測DO和pH的功能允許自動灌注和氣體交換從而減少了體力勞動和介質消耗。其中，Xuri W25細胞袋經過特別設計，更適用于免疫細胞，如T細胞的灌流培養。 ? ?

Cytiva波浪式生物反應器? ??

Wilson Wolf的G-Rex系統

懸浮細胞培養另一個重要的設備是G-Rex燒瓶，由Wilson Wolf設計和制造。G-Rex是一個圓底圓柱形燒瓶，底部有一個特殊的透氣硅膠膜。容器中充滿培養基，然后接種細胞。細胞在培養過程中沉淀，瓶下半部分密度高，上半部分密度低，并在膜上形成一厚層。這是一種高細胞密度培養方案，大的培養基體積提供了充足的營養物質，而硅膠膜確保了有效的氣體交換，從而降低了缺氧的風險。細胞在燒瓶底部形成一層致密層，這使得在不干擾細胞的情況下很容易補充培養基。 ? ?

G-Rex系統的優勢包括低介質消耗和與標準實驗室設備（如層流柜和CO2培養箱）的兼容性，與傳統培養袋相比，這顯著降低了細胞培養操作的技術要求和成本，有助于實驗室、臨床前和臨床環境中的放大。G-Rex容器也比T瓶更有效，更適合在符合GMP的條件下生產各種細胞產品。

G-Rex系統在與用于免疫治療細胞產品制造的自動化GMP協議集成方面存在一些缺陷，特別是在細胞接種和質量控制階段。這些問題主要是由于難以以密封和無菌的方式將大體積從燒瓶轉移到其他設備，例如用于洗滌和緩沖液交換。此外，還包括取樣和容器最大體積有限的問題。盡管有這些缺點，G-Rex仍然是擴大生物技術流程的最流行解決方案之一，并廣泛用于免疫治療制造。

總體而言，G-Rex燒瓶已被證明是一種經濟高效的解決方案，顯示出較高的細胞培養效率。 ? ?

? ? ? ? ?

攪拌瓶和攪拌罐生物反應器

攪拌罐生物反應器更常用于在HEK293細胞中生產病毒載體，也可用于干細胞（需要微載體）和多能干細胞（PSC）的培養，但通常免疫細胞的擴增不采用此方案，因此不展開介紹。市場占有率比較高的品牌有荷蘭艾貝泰Applikon，德國賽多利斯Sartorius的Ambr系列以及艾本德Eppendorf等。? ?

Applikon ez-2 control和Eppendorf BioFlo 320

Sartorius的Ambr 250和B-DCU? ? ? ?

?

6.細胞洗滌回收

臨床使用的細胞用量往往達到每個病人10⁷~10⁹數量級，培養如此多數量的細胞一般需要數升體積的培養基。把細胞從如此大體積的培養基中回收并洗滌成為了另一個問題。傳統手工操作的方法是離心，但是離心的體積很有限，而且操作十分繁瑣（每次要低速離心30分鐘，洗滌要洗滌三次），并且因為需要敞開式操作，也增加了污染的機率，不符合先進細胞生產的要求和理念。新鮮和冷凍起始材料的質量會影響最終產品。另外，細胞灌裝之前還需要洗滌，比較成熟的方法主要是離心換液和半透膜。該步驟的目的是將培養基換成凍存液，對細胞進行洗滌，該工序要確保細胞狀態盡量不受到傷害，回收率需達到要求。因此，連續細胞回收系統成為了一個非常有用的設備。 ? ?

Cytiva的 Sepax C-Pro和Sefia S2000系統

2017年上市GE Sepax C-Pro細胞處理系統區別于傳統離心機，是基于Biosafe Group的軸向離心專利技術，用于處理細胞的一種自動化、功能性封閉技術的設備。 ? ?

C-Pro市場占有率達到80%。主要特點有：自動化、封閉式，可處理體積范圍一般為50~1200mL；終體積控制8-500mL±5ml；功能涵蓋：①通過去血漿的方式濃縮單采血中的白細胞；②從單采血中去除血小板，從而濃縮白細胞；③密度梯度離心法富集單個核細胞；④細胞和磁珠孵育，并清洗；⑤病毒轉導；⑥稀釋、濃縮和洗滌細胞；⑦稀釋和分裝細胞產品到多個終產物袋中。 ? ?

Sefia S-2000細胞處理儀是Cytiva推出的大體積連續流細胞處理系統，SefiaS-2000細胞處理儀結合PremierCell Sefia協議軟件和CT-300.1 Sefia細胞分離套件，可以從多達880ml的單采產品中分離細胞；若配合FlexCell Sefia軟件和CT-800.1 Sefia細胞分離套件，則可以收獲高達10L的擴增細胞。

Sepax C-pro和Sefia S-2000

類似的其他廠家的同類產品還有

Thermo Fisher CTS? Rotea?逆流離心系統；

CTS? Rotea?能夠與賽默飛其他設備像Xenon電轉儀，搖擺式生物反應器Rocker等組合成CTS細胞生產平臺，而且也能與市面上的其他工藝設備比如細胞工廠，G-Rex培養瓶實現工藝銜接。 ? ?

CTS? Rotea?逆流離心系統? ? ?

?

Millipore Sigma Ekko系統

Ekko是使用低能量超聲技術進行過濾分離的封閉式細胞處理系統，其超聲室設計通過重力、流體阻力和初級和次級聲力的組合，使細胞聚集最大化，從而能夠“捕獲”如淋巴細胞這樣的低密度細胞，因此更適用于處理高聲學對比度(如微載體)和高細胞密度(如單采單元)的原料，可以直接進行灌注。 ? ?

Fresenius Kabi Lovo系統

LOVO是一種通過旋轉膜過濾技術清洗、濃縮和純化白細胞的自動化細胞處理系統。該系統使用的是獨特的微旋流技術，對細胞損傷低。該系統優勢是最大可處理21L的原液體積，其源液去除率最高可達99.9999%。其細胞洗滌采用懸浮法，避免了離心法會導致的細胞堆積問題。該系統的高效換液使其能夠快速去除血小板或其他小分子物質，減少純化步驟。但不能分離紅、白細胞，主要用于細胞洗滌；終產品有最小體積限制（＞50mL）。 ? ?

Lovo系統

Sartorius Ksep系統

賽多利斯的Ksep專利技術，該系統可以選擇性地清除細小顆粒雜質，例如產生的塑料、細胞碎片、細胞外病毒等，在生產過程中進行分離。Ksep系列的封閉式細胞處理系統包括Ksep400和Ksep6000S。Ksep6000S有6個處理室，每個處理室的體積1L，能夠連續處理高達6000L的體積。Ksep400可在2小時內完成50L多能干細胞的洗滌濃縮過程，細胞回收率達到90%以上，且對細胞活力沒有負面影響。 ? ?

Sartorius Ksep 400和Ksep 6000S

7.細胞冷凍保存

細胞制品無論是最終做成制劑還是建庫經常需要冷凍保存。而細胞制品有別于其他生物制品，需要經過程序降溫才能避免快速降溫帶來的過快生成冰晶對細胞膜的損害?？蒲屑壍膬龃嫱w積不大，細胞不多，用一般的程序降溫盒（泡沫或內置異丙醇的塑料盒）就可以實現。但是臨床用的細胞制劑因為體積大細胞多，臨床級的細胞要求精確，因此需要專門的程序降溫儀進行凍存。目前比較主流的程序降溫儀有Thermo的CryoMed和法國卡蘇CBS-Digitcool的程序降溫儀。 ? ?

Thermo CryoMed程序降溫儀

CBS Digitcool程序降溫儀

8.細胞復蘇

和凍存面臨的問題一樣，科研水平的細胞復蘇往往用水浴鍋，而制備級臨床用細胞從冷凍狀態下復蘇亦需要專門的設備。目前比較主流的有Cytiva的VIA Thaw和Barkey干熱式細胞復蘇儀。 ? ?

Cytiva VIA Thaw自動干熱式復蘇儀

Barkey干熱式細胞復蘇儀? ? ? ? ?

9.細胞制劑灌裝

細胞擴增、洗滌完畢后，不管是做成臨床制劑，還是在生產、流通各個環節中需要凍存、建細胞庫，都需要對細胞進行分裝。傳統隔離器中用移液管手工分裝難以標準化，不精確，費時費力，敞開式操作容易污染，通量小，難以放大規模。如何在更高要求的生產過程中高通量快速分裝，同時保證分裝的精密度、細胞活率、細胞功能的完整性等？取代人工的灌裝機應運而生，目前市面上有兩類灌裝機，一類仿制Terumo的FINIA，例如賽橋、中博瑞康等，通過擠壓終產品袋實現細胞混勻并通過蠕動泵灌裝；另一類通過萬向搖動混勻器實現混勻，并經由蠕動泵灌裝；兩種方式各有優劣，但后者更易于放大且將低溫混勻和灌裝兩部分做成模塊化設計，滿足不同階段客戶需求；真正做到了兼容自體和通用型細胞療法的分裝工藝。 ? ?

Terumo FINIA

國內廠商蘇州信號級聯自主開發的Biobro Sep1采用的第二種方案，集合了4℃控溫，混勻和精密灌裝，可以在1小時內完成100個 250ml凍存袋的灌裝(每袋灌裝70-100ml)，而且單次最大可以支持 7L 細胞終產物的處理，保證通用細胞產品的同批次生產。目前在國內已有多家IND聯合申報案例。 ? ?

BioBro Sep1? ? ? ? ?

10.無菌接管機

無菌接管機是一種在非無菌環境中將兩根pvc管路結合，并保持連接件無菌條件的醫療器械。在細胞治療的各個環節之間，因為需要在C級條件下進行全封閉無菌對接，因此接管機成為了一個必不可少的設備。目前市面上比較主要的型號有泰爾茂的TCSD II無菌接管機。國內廠商賽橋除了有臺式設備PortWelder無菌接管機以外，還有更加方便的PortSealer手持式熱合儀供選擇。

泰爾茂 TCSD II 無菌接管機

PortWelder無菌接管機和PortSealer手持式熱合儀

11. 質量控制中涉及到的設備

IPC/QC在生產中非常重要，常規檢測包括pH值、無菌檢測、支原體檢測、內毒素鑒定、CAR基因拷貝數、慢病毒殘留、細胞因子釋放。

質量控制中主要涉及的設備有檢測細胞用的流式細胞儀，目前流式細胞儀主流品牌一是美國BD公司，一是貝克曼公司，Thermo的Attune流式系統的實驗室也較多。其他還有一些分子生化實驗室常規的設備，如定量PCR儀，酶標儀等。本文不展開詳述。

下表是對上文所述設備的匯總 ? ?

? ??

五、自動化制備意義與未來

免疫細胞療法作為CGT領域中走在最前列的先進醫學療法，相比傳統藥物，其生產制備具有很多特別之處：首先細胞是一種活物，其對培養、加工環境的敏感性更高，因此在制備過程中需要小心保護細胞的活力和狀態，不能損壞細胞膜等細胞結構；其次目前的免疫細胞療法以CAR-T為主，現在上市的產品都是自體產品，需要每個病人定制。加上質粒病毒制備等，生產成本特別高。如何降低細胞生產成本，其策略之一就是開發同種異體的細胞療法。一旦需求上升，擴大產量，就可以攤薄單一制劑的制造成本；第三是細胞療法作為一種新興的療法，目前其工藝生產開發還處于不斷改進階段，早期的手工操作會逐步轉變為自動化操作。自動化的優勢很多，上文已有描述：標準化；全封閉；一次性耗材，無需清潔驗證；減少人工操作，穩定性高；全過程電子信息化。毫無疑問，自動化是細胞生產未來的趨勢。 ? ?

目前CAR-T治療最讓人詬病的是其高昂的治療費用和巨大的生產成本。降低成本亦是整個行業發展的方向。而采用昂貴的自動化設備到底是增加了成本還是能降低成本呢？以后我會撰文進行詳細的核算。但是可以想見的是，一旦細胞生產規?；?，其前期在設備上的大額投入，可以通過節省人員成本、節省潔凈區成本和生產高效率來收回。目前各家主流公司已經在走這條路。譬如全自動生產設備Prodigy或Cocoon規模化的布局使用后，未來充滿科技感的細胞治療生產現場可能就如以下圖片展示：

擺滿Cocoon的生產環境? ? ? ? ?

?

因此本文認為未來的細胞生產一定走的是現代化、自動化、無人化的路線。新工藝方案取代舊工藝方案這個趨勢毋庸置疑。