本文主要內容是以CAR-T為例，介紹T、NK、DC、巨噬等免疫細胞工藝開發與生產過程中，規范化規模化涉及到的主要自動化設備。本文可以用作細胞治療企業工藝改良參考，亦可用作新成立細胞治療Biotech公司或新建實驗室的設備采購指南。
細胞治療區別于化藥、蛋白藥，是指以細胞作為藥物，利用自體或異體的成體細胞或干細胞對組織、器官進行修復的治療方法。現在比較主要的細胞治療包括了干細胞（臍帶、脂肪等來源的間充質干細胞，胚胎干細胞或誘導多能干細胞iPSC來源的細胞）治療和以T細胞，NK細胞，DC細胞，巨噬細胞等為代表的免疫細胞。其中以經基因工程改造的T細胞的CAR-T療法為代表已經有多個產品在世界范圍批準銷售。截止目前（2023年12月），加上上個月在中國剛剛獲批的合源生物的納基奧侖賽，全球已有7個抗CD19 CAR-T細胞商業化產品批準上市（美國4個，中國3個），另外還有3個抗BCMA CAR-T批準上市。自體細胞療法使得規模化、標準化的生產提出很大挑戰，企業往往需要靈活工藝：全球獲批的10款CAR-T細胞產品均為自體細胞療法，治療過程需要經過患者抽血、體外制備（激活、轉染、擴增）、檢驗放行、凍干運輸、回輸患者體內等多個步驟。細胞藥的特點是：CAR-T是患者自體免疫細胞單人的細胞治療產品。不同于傳統生物制品，CAR-T藥物的生產工藝必須為每個病人單獨制備。 ? ?CAR-T治療程序涉及醫院與工廠（生產）。在醫院，醫生采集患者血液樣本，通過冷鏈或超冷鏈運輸至制備中心。由于患者的T細胞較為脆弱，在運輸過程中，運輸時間長短和運輸溫度是影響PBMC（外周血單核細胞）的質量、活性、回收率的高風險因素，如果PBMC不達標將無法進入下一步制備。在CAR-T細胞制備中心，GMP工廠接收供體的血袋，從PBMC中分離T細胞，激活分離出的T細胞，并通過病毒轉導或電轉導對其進行基因工程改造，以此表達CAR。將激活后的T細胞放置在專門細胞培養容器或儀器以及專門的培養基中擴增，使其達到一定數量，通常需要7-10天，然后將其冷凍保存，接著對冷凍保存的CAR-T細胞產品進行分析，最后將其運送到醫院，解凍后輸注到病人體內。這一制備過程非常復雜，其中T細胞分選效率、T細胞轉導陽性率是制備出合格有效CAR-T細胞的CKI（關鍵指標）。由于轉導后的T細胞更為脆弱且在GMP級別制備細胞不允許適用抗生素等，T細胞擴增培養與其他細胞相比難度更大。最后，將制備好的CAR-T細胞凍存運輸回治療中心也存在較高風險。 ? ?
CAR-T流程概念圖（來源網絡）
免疫細胞涉及的生產工藝環節眾多，以經典的CAR-T制備為例：可拆分為質粒、病毒、細胞的生產工藝三個相對獨立的環節，其中: ? ?
1)質粒工藝流程:質粒是直接轉染細胞或制備病毒載的重要原料。根據使用目的、所選用病毒載體的不同，質粒的生產要求也不同。如在慢病毒載體的構建中，需構建質粒共轉293T細胞的三質粒或四質粒組裝病毒系統。生產周期一般為7-10天。
2)病毒工藝流程:目的是生產病毒載體用以作為遺傳物質遞送系統。細胞與基因治療領域常用的病毒載體包括逆轉錄病毒、腺相關病毒、腺病毒、慢病毒等。生產周期一般為2-3周。
3)細胞工藝流程:涉及細胞的培養、激活、轉導、純化、富集等步驟根據細胞的來源可分為自體療法與異體療法。生產周期一般為10-15天。
CAR-T生產工藝流程中還包含質控、質檢、分析方法開發與驗證等步驟。而在質粒、病毒、細胞生產流程的終點還需放行檢測，合格才可成為商品化的CGT產品。上述三段工藝流程中，質粒和病毒的生產相對標準化，專業化外包能夠降低生產成本、加快生產流程，而細胞治療工程則需要利用自動化設備，企業前期投入成本較大。此外，根據FDA的規定，細胞治療產品在申報IND時就必須確定生產工藝，此后若有重大變更須申報驗證。因此，CAR-T產品工藝開發、放大與GMP規范下的規模化生產成為了較高的技術壁壘。? ??
其中，細胞工藝流程技術路線分為開放式與封閉式，封閉式又分為全自動、半自動與隔離器手工操作。目前全球范圍內半自動化與隔離器人工操作為較多采用的兩種路線。半自動化設備以Cytiva、ThermoFisher等為代表，凱特、諾華、藥明巨諾等多采用此路線；隔離器人工操作硬件門檻較低，花費不高，是很多對成本預算敏感公司的首選。? ??
傳統的細胞制備不需要高端復雜的設備，一般潔凈區實驗室有基本的細胞生物學設備都可以滿足。但有一個重點需要注意，就是手工操作是在敞開式的環境中，所以需要在潔凈區安放潔凈臺，而且用于生產的臨床級細胞，要求符合GMP要求，因此通常需要B+A以上級別的潔凈區。這對潔凈區的硬件要求、管理、維護，對使用潔凈區人員的耗材、培訓，都會增加不小的負擔。
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隨著行業的發展、現實的需求和技術的進步，各個廠商逐步開發了一些自動化的設備來滿足工藝開發和生產的需要。這些設備分為全自動和半自動設備，其主要特點是：1.標準化，大部分符合GMP生產要求以及21 CFR生產記錄及質量控制要求；2.全封閉，在各個環節中全部在封閉容器中進行，各個環節間也用無菌管路對接，因此全程保證無菌，而且不再要求在B+A潔凈區中操作，只需要在一般C級潔凈區即可完成，降低了對操作場地硬件的要求，從而降低了運營建設成本；3.多使用一次性耗材，如管路、發酵罐、培養袋等，因此無需清潔驗證，對生產的穩定性安全性提供了更好的保障；4.最大程度減少人工操作，避免不同人員不同批次操作的偏差，保證穩定性。同時可一人控制多臺機器，大大提升效率的同時降低勞動成本； ? ?5.全過程電腦控制、記錄，便于管理和規范生產。? ? ? ? ?
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全自動化設備主要有美天旎Miltenyi的CliniMACS Prodigy和龍沙Lonza的Cocoon兩個系統。 ? ?
CliniMACS Prodigy，一個人控制面板就能完成所有操作 ? ?
1.Miltenyi的全自動化、封閉式、多功能細胞生產平臺CliniMACS Prodigy，可駕馭復雜的臨床級細胞制備，包括全自動完成分選、激活、轉導、擴增、制劑、凍存等步驟。可應用于多種細胞的制備：如病毒轉導/電轉CAR-T細胞的制備；樹突狀細胞的富集和培養；造血干細胞的基因工程改造；移植工程（CD34富集，TCRα/β去除，CD45RA去除）；NK細胞富集、培養和編輯；病毒特異性T細胞的分選；貼壁細胞及其衍生物的制備；調節性T細胞的富集。
與CliniMACS Prodigy配套的主要試劑為磁珠、激活試劑、細胞因子、細胞培養基等；主要耗材為一次性管路、離心培養一體化Chamber、取樣袋。
據美天旎統計數據，2021年時全球已有31個國家，超過50個細胞/基因治療公司采購了CliniMACS Prodigy，全球有超過40個臨床試驗正在使用這臺設備。 ? ?
2.Lonza的Cocoon平臺是一種功能封閉、自動化和可拓展的個性化療法生產解決方案，可通過模塊化設計，適用于懸浮細胞、貼壁細胞生產，包括T細胞在內的各類血細胞、免疫細胞，集成了磁珠分選、病毒轉導或細胞轉染、細胞活化、增殖、收獲在內的多個步驟。Cocoon作為封閉式細胞生產平臺，摒除以往昂貴的A+B環境，采用C級環境即可完成操作，能夠滿足CAR-T、TCR-T、TIL、MSC等工藝需求。Lonza的Cocoon?自動化生產增強了可控性以及可復制性，能夠切實的滿足產品從PD生產工藝到IND的過渡，并且符合GMP生產要求，只需平行放大，以此快速實現產業化的落地。 ? ?
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半自動路線在細胞療法各生產環節分別由專用設備完成，是目前最主流的技術路線，設備以進口為主，國內廠商突破主要集中在擴增系統、凍存復蘇及冷鏈。
血液分離系統，俗稱“單采機”，是從獻血者或病人身上抽取全血，添加抗凝劑，分離血液成分，采集單核細胞，去除特定成分，然后將未采集的成分回輸給獻血者或病人。在治療性血漿置換和紅細胞置換過程中不斷回輸適當的替換液。日本泰爾茂Terumo采血系統市占率30%左右。其中主要包括COBE Spectra系統和Spectra Optia系統等。
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左：Spectra Optia；右：COBE Spectra ? ??
在CAR-T細胞產品的整個制備流程中，T細胞的分選和激活是最關鍵的工藝環節，直接影響到CAR-T細胞的抗腫瘤活性。進行T細胞分選可以帶來如下好處：
終產品質量保證：減小起始樣本中單核粒細胞和B細胞的污染；批次間差異減小。
優化培養條件：足夠的T細胞百分比確保T細胞的后續擴增和激活。 ? ?
減低成本：在慢病毒轉導前有更明確的細胞分群組成；避免病毒載體浪費，提高轉導效果。
目前針對T細胞的分選及激活主要有2種策略。一是以美天旎的Microbeads為代表納米級別磁珠為基礎的分選，主要策略包括有CD4/CD8的分選或CD3的分選，聯合后續納米級別的CD3/CD28抗體激活試劑；二是以賽默飛Thermo Fisher的Dynabeads為代表的微米級別磁珠直接偶聯CD3/CD28抗體對T細胞進行分選及激活。
市場上納米級別磁珠的大小在50-500nm之間，分為有柱式分選和無柱式分選。無柱式分選操作簡單快捷，無需負擔分選柱的耗材成本。無柱式分選由于納米級別磁珠的磁力作用相對較弱，需要添加大量的磁珠抗體與細胞表面抗原結合，而過量的磁珠抗體標記可能對細胞的信號通路產生激活從而影響細胞功能，因此往往應用于陰性分選。另一方面，無柱式分選操作中存在開放操作步驟，如需應用到GMP生產，需要在A級環境進行操作。 ? ?
有柱式分選，可通過分選柱結構有效增大磁場強度梯度，磁珠大小在50-100nm之間，少量的磁珠標記，細胞就可被分選出來，且無需對磁珠進行去除。借助于分選柱的密閉結構，可將整個磁珠分選的步驟在全密閉的自動化系統中完成，這也是目前CGT行業進行細胞分選的金標準之一。以美天旎CliniMACS Plus為代表的臨床級別自動化設備廣泛應用于細胞治療領域。 ? ?
CliniMACS Plus細胞分選儀? ? ? ? ?
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國內廠家金斯瑞同樣應用納米分選磁珠和有柱式分選方案，自主研發的CytoSinct 1000細胞分選儀亦可以實現全封閉、安全高效、自動化的細胞分選流程，配合其自主開發的免疫磁珠，可以實現對包括T細胞、NK細胞、單核細胞、干細胞等多種細胞的富集和去除，可適用于多種細胞治療產品的標準化生產。和美天旎相比，該產品還配備了審計追蹤系統，符合21CFR Part 11要求，增加了工藝流程的合規性。另外，操作軟件通過與自主研發的分選管路搭配，使得操作流程更加清晰、便捷。和其他國產設備相比，金斯瑞配套管路關鍵部位分選柱和GMP級的磁珠亦是自主研發生產的，具有相當的整體實力。 ? ?T細胞的另一種激活分選策略則采用微米級別磁珠直接偶聯CD3/CD28抗體，將分選和激活兩步二合一。以賽默飛Dynabeads為代表的4.5μm級別的激活磁珠也是目前T細胞激活的另一主流產品。微米級別磁珠具有更強的結合能力，更強的激活效果。且微米級別磁珠無需分選柱結構即可完成分選，節省了分選柱的耗材成本。但監管法規要求對微米級別磁珠在最終產品的殘留進行檢測，并達到相應標準，因此需要對激活擴增后的細胞進行磁珠去除的操作。CTS? DynaMag? Magnet磁力架可對Dynabeads結合的細胞進行分選，并對培養后的細胞進行磁珠去除。整個操作流程可在全密閉的管路及袋子中完成，但需要手動調整磁鐵的角度，控制液流速度，從而達到最佳的分選或去除效果。 ? ?國內賽橋生物推出Gentle m-MACS自動化磁分設備，配套一次性密閉耗材，實現自動化微米級和納米級磁珠分選及去除，軟件設計符合21CFR part11的要求，全流程可追溯，彌補整個CAR-T制備工藝中磁珠分選的自動化及可追溯性工藝需求。 ? ?賽橋生物Gentle m-MACS微米磁珠全自動分離選擇處理設備T細胞活化對于CAR-T細胞轉導效率至關重要。在體內是通過抗原呈遞細胞（如樹突細胞DC）刺激天然T細胞的增殖和分化。為了避免與DC共培養繁瑣的過程，已經開發并實施了幾種模擬T細胞天然刺激的方法。常見的方法是加入OKT3（抗CD3單克隆抗體mAb）和白細胞介素IL-2。目前臨床上，激活T細胞的主要方法是用抗CD3/CD28抗體包被的順磁珠激活。抗CD3/CD28 mAb和IL-2也占了1/3，其中包括了KITE Pharma的Yescarta。? ?利用基因工程技術，通過逆轉錄病毒和慢病毒載體、轉座系統（如睡美人SB轉座系統/PiggyBac轉座子）或直接將mRNA轉導到T細胞內，使T細胞表面表達嵌和抗原受體（CAR），即成為CAR-T細胞，擁有識別癌細胞和增殖的作用。其中，逆轉錄病毒和慢病毒載體是CAR-T細胞生產中最常用的基因轉導方法，其他方法還有電轉：龍沙Lonza Nucleofector細胞核轉染系統結合電穿孔技術和細胞特異性轉染液，將外源基因高效導入目標細胞的細胞質中，并可直接入核，整合到細胞染色體中。新一代龍沙Lonza 4D-Nucleofector細胞核轉染系統，市場占有率60%-70%，適用于不同類型細胞，包括傳統上很難轉染的原代細胞、多能干細胞、免疫細胞、神經元等；模塊化設計，可單獨配置不同功能模塊/單元，兼顧了轉染的靈活性和設備體積規模。 ? ?Lonza 4D-Nucleofector細胞核轉染系統賽默飛 Thermo Invitrogen Neon和Xenon電轉染系統 ? ?CTS Xenon 大規模電轉染系統，保持了與其小電轉系統Neon一致的脈沖配置和開放的操作平臺，通過簡單的優化，滿足大體積、符合GMP生產需求，為通用CAR-T、CAR-NK、TIL、TCR-T等創新療法提供了非病毒生產的新選擇。Gibco CTS Xenon電轉染系統特點：處理量大且快速：處理量為1–25mL，25min內能夠轉染多達2.5×10?個T細胞；性能可靠，可保持高細胞活力：高達90%的基因敲除效率和80%的細胞活力；非病毒性物理轉染：可用于遞送DNA、RNA和蛋白質；封閉式系統處理工藝：MultiShot耗材可無菌焊接至PVC管或C-Flex管。 ? ?CTS Xenon Electroporation 系統
國內廠商蘇州壹達自主研發的X-Porator M1 GMP級連續流式大規模電轉染系統，專門用于細胞治療工藝開發和生產，單次可電轉100ml體積，單次處理細胞量達到了1010，具有穩定的轉染效率。配合其自主研發的一次性USP Class VI醫療級耗材，PVC材質管路，通過6項第三方生物安全驗證。軟件亦符合 21 CFR要求，包含三級權限管理，符合GMP和FDA Master file要求。特別針對非病毒載體轉導細胞、基因編輯細胞等的工藝與生產。與其小型電轉儀H1具有良好的放大線性。 ? ?
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