外泌體到底該如何保存？

在我們研究和應用時，經常會被問到外泌體保存相關的問題。例如，我的外泌體已經在4度放了一周，還能做使用嗎？我是1個月前提取的外泌體，一直放在-80度冰箱，還能繼續(xù)檢測和應用嗎？我的外泌體放在-80度冰箱兩個月了，還能提取外泌體做檢測嗎？我在某地，寄樣本去某城市做應用，可以用冰袋或干凍快遞寄送嗎？會不會有質量問題，諸如此類………

回答以上問題，我們應該以嚴謹?shù)膽B(tài)度和方法，去文獻中和科學研究中尋找可參考的信息，抑或——最科學的方式——自行做對照實驗去探究。

不同的外泌體不同的功能

外泌體（Exosomes）是細胞分泌到胞外的一種囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小為30-150nm，具有雙層膜結構和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內含物（包括核酸、蛋白和脂質等），參與細胞間的分子傳遞。外泌體廣泛存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同時也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。

外泌體的高效提取、分離和完整保存是研究其在機體內生物學作用和功能的重要前提,也是制約基于外泌體的臨床檢測技術和治療載體技術的關鍵。

所有的細胞都能分泌外泌體，但是不同細胞分泌的外泌體不管在數(shù)量上還是在內含物中都具有很大的差異性，這也決定了每種外泌體所行使的功能不一樣。外泌體廣泛參與細胞間物質運輸與信息傳遞，調控細胞生理活動。同時，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導正常細胞轉化、促進腫瘤發(fā)生和轉移等作用；此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進行藥物遞送。

外泌體提取純化技術

外泌體可以由體內或體外培養(yǎng)的幾乎所有類型 的細胞分泌, 并廣泛存在于血漿、膽汁、尿液、母乳、 唾液、胸腔積液、淋巴、胃酸、支氣管肺泡灌洗液、 腦脊液、眼淚、精液、滑膜液、羊水、腹水、鼻分 泌物和子宮抽吸物液體等體液中。目前, 基于不同的分離原理, 研究者建立了五種主要的提取純化 技術, 分別為基于質量密度的超速離心技術、基于粒 徑大小的分離技術、基于溶解性質的聚合物沉淀技 術、基于免疫親和原理的分離技術和基于流體性質 的微流控技術等。

從生物體液中分離外泌體的各種方法已經被開發(fā)出來，主要根據外泌體的大小、密度、免疫特性等特點進行操作。分離出高純度的外泌體是我們后續(xù)開展外泌體研究的關鍵步驟，目前差速超速離心是外泌體分離方法中公認的“金標準”，也是目前最常用的 外泌體分離和濃縮方法。該方法可通過結合0.22 μm或 0.45 μm孔徑濾膜進行超濾來提高產物純度減少外 泌體的聚集, 其分離效率容易受到加速度、轉子類 型、旋轉半徑、沉降路徑長度以及樣品黏度等多種 因素影響。

密度梯度離心是基于差速超高速離心的改良 技術。該方法需預先利用常用的梯度液介質如蔗糖、 碘克沙醇和氯化銫等, 在離心管中構筑從底部 到頂部密度逐漸降低的密度梯度帶。

根據密度梯度構建和沉降方式的不同, 又可以分為速率區(qū)帶離心法和等密度梯度離心法, 前者主要根據顆粒的沉降 速率分離, 介質密度均小于外泌體密度, 離心時樣 品在向超速離心管底部移動時, 會通過密度不斷增加的密度梯度區(qū)帶, 密度大的顆粒更容易穿過密度更高的梯度層, 更快地到達管底, 因此控制離心的時間很重要; 等密度梯度離心法中的密度梯度區(qū)帶, 則會根據樣品液中各種溶質成分來進行組合, 離心過程中, 無論離心時間多久, 不同密度顆粒僅會富集到 具有相同密度的梯度區(qū)帶, 而不會沉淀到底部。

外泌體差速超速離心

外泌體的保存

外泌體是具有雙層脂膜的囊泡結構, 其穩(wěn)定性較好, 可保護內部生物分子免受體液中各種酶的影響, 從而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌體的完整性和生物活性也可能受到保存介質、保存溫度和時間等因素的影響。

外泌體被提取后一般懸浮于磷酸鹽緩沖液。

目前, 最常用的儲存方法為冷凍保存, 但是冷凍保存可能會導致外泌體形狀與物理性質的改變, 也可能導致多層囊泡的形成和聚集, 反復凍融會導致外泌體表面分子的生物特性、含量和標志物組成發(fā)生變化。

血清中包含外泌體在內的細胞外囊泡DNA 在不同儲存環(huán)境可保持穩(wěn)定, 血漿存放于4 °C時其 RNA會顯著降解, 在–20 °C下長期保存也會導致血漿中外泌體總RNA降解, 但miRNA卻十分穩(wěn)定?這也提示了外泌體miRNA作為生物標志物的潛力。

不過也有研究表明, 血清中的miR-122和miR-145非常不穩(wěn)定, 將血清在4 °C短期保存期間即發(fā)生降解, 這可能是由外泌體的異質性所導致的。–80 °C保 存被公認是保存各種生物標本如精液、尿、牛奶、 血液和支氣管肺泡灌洗液最適宜的保存環(huán)境雖然這樣保存血漿可能產生含有大量“污染物”的外泌 體。4 °C保存雖然容易導致外泌體中蛋白和核酸的損失, 但卻能夠避免凍融過程造成的囊泡破壞。

外泌體雖然建議保存于?80 °C環(huán)境下, 但在 處理或運輸過程中有時很難維持這種低溫條件。研究發(fā)現(xiàn)一種凍干法以保存外泌體, 在冷凍過程中使用海藻糖作為保護劑, 海藻糖可以提供生物保護作用, 如穩(wěn)定蛋白質、細胞膜和脂質體; 減少冷凍過程中冰的形成; 防止蛋白質 以及外泌體的聚集; 減少分離和保存過程中細胞外囊泡的損失等。

值得注意的是, 不同來源的外泌體因其異質性在相同環(huán)境下保存, 其穩(wěn)定性可能會大有不同。研究發(fā)現(xiàn), 精液經過長達30年的–80 °C 冷凍保存后, 其外泌體的形狀、物理性質、核酸蛋白含量和種類都沒有顯著變化。相反, 支氣管肺泡灌洗液中外泌體冷凍保存樣品與新鮮樣本相比, 體積變大且有一半以上種類蛋白質的豐度發(fā)生變化甚至消失。因此, 不同種類來源的外泌體最佳的保存條件仍需探討。

?實驗室中常規(guī)的外泌體存儲條件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一項研究中，研究者評估了儲存在4℃，-20℃和-80℃下長達28天的外泌體的穩(wěn)定性，并將其與新鮮的外泌體進行了比較。在一項研究中，研究者評估了儲存在4℃，-20℃和-80℃下長達28天的外泌體的穩(wěn)定性，并將其與新鮮的外泌體進行了比較。

研究者發(fā)現(xiàn)，與新鮮分離的外泌體相比，不同的存儲溫度和存儲時間會影響外泌體的穩(wěn)定性、大小分布和顆粒數(shù)量（Fig.1），并影響了外泌體的細胞吸收和生物分布（Fig.2）。對于功能性研究，根據研究設計建議對新鮮分離的外泌體進行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對于長期保存用于治療應用的外泌體，-80℃存儲條件將是更可取的。

不同存儲條件對外泌體大小和結構的影響

不同存儲條件對外泌體蛋白成分的影響

實驗結果：結果顯示，在-20℃和-70℃下保存的外泌體比較完整無損，而4℃和室溫下CD63已基本沒有表達，室溫保存條件下HSP70的表達量也有所降低。相較于4℃、-70℃和新鮮樣本，室溫存放的外泌體蛋白和RNA濃度的降低程度較明顯。研究說明，-20℃或更低溫度是比較可取的外泌體長期存儲條件。

外泌體鑒定

外泌體分離之后，需要經過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標志物，多角度進行鑒定。主要方法包括：

透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察，即通常為茶托型或一側凹陷的半球形。

納米顆粒跟蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

Western blot分子標志物檢測：外泌體標志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細胞質蛋白，如肌動蛋白（Actin）和鈣磷脂結合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細胞分泌的特異性蛋白。

親脂染料標記外泌體：目前已發(fā)表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標記，體內和體外都有較多應用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是PKH67（綠色熒光）/PKH26（紅色熒光），由于它們可以與外泌體的脂質雙層膜穩(wěn)定結合，所以染色效果較好，應用較廣泛。

干貨，外泌體常見問題:

1、分離方法適用于哪些種類樣品中的外泌體提取？

可用于細胞上清液、血清、血漿、尿液及其他低密度體液（如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、 唾液等）的外泌體提取。

2、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存？

可以。血樣、尿樣、體液等，需要攢齊了一起提取，或者同一個患者的樣本多次提取。凍存 前，首先要離心去除細胞和血小板，再將樣品分裝凍存于-20 或-80℃。但如果有條件最好 還是用新鮮樣品立即進行提取。長期請保存于-80℃，無須加凍存液；短期（1-2 天內）則 保存于 4℃即可。

3、外泌體提取后是否可以凍存？

可以。使用硅化 E.P.管或凍存管，減少 exosome 的粘附。Exosome 能夠承受反復凍融，建議 分裝，避免多次反復凍融。對于一些功能性實驗，建議不要凍存，直接使用新鮮提取或保存 在 4℃懸浮于 PBS 中的 exosome。4℃保存不超過一周，-80℃條件下可長期保存。

4、需要從血漿中分離外泌體，可以使用肝素或 EDTA 管去收集血液樣本嗎？

不可以。肝素將會大大損害接下來的 RNA 實驗。EDTA 也許會干擾 PCR 實驗。使用無肝素無 EDTA 管去收集血液樣本。立即離心樣品收集血漿用于 exosome 分離。如果必須使用抗凝劑， 用 EDTA 管收集血液。如果有必要的話在接下來的 PCR 反應中調整 Mg++的濃度。采血管的選 擇：血漿（plasma）：紫蓋采血管；血清（serum）：黃蓋采血管（促凝管或促凝管帶分離膠）。

?5、粘度過大的樣品如何處理？

如果樣品粘度過大時（因細胞分泌物較多所致），可將樣品用 1×PBS 緩沖液進行等體積稀釋。

6、培養(yǎng)細胞時，如何去除血清來源的外泌體？

多數(shù)情況下，細胞在體外培時養(yǎng)需要血清，而血清中一般都含有外泌體，為避免血清對細胞 外泌體的污染，可采用以下兩種方法：（1）將細胞培養(yǎng)用的血清通過 1×105g 超速離心 10h 以去除血清外泌體；（2）選擇無血清培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。

?7、無外泌體血清培養(yǎng)基（或者無血清培養(yǎng)基）在什么時候使用？

細胞在正常含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時間后，細胞融合度約為 60%-70%時，移去原有含 血清的培養(yǎng)基，換成新鮮的無外泌體血清培養(yǎng)基（或者無血清培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng) 24-48h， 細胞融合度達到 80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。

8、細胞培養(yǎng)過程中的死細胞是否會影響外泌體的提取？

會的。在收獲細胞時，應確定死亡細胞占比不超過 5%。細胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大 小不等的囊泡，它們在外泌體的提取純化過程中會污染活細胞產生的外泌體。

9、如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測（形態(tài)）、粒徑檢測（大小）、Western blot 檢測等方法鑒定提取的 外泌體。在進行 Western blot 檢測時，通常檢測外泌體標志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101 等），按照國際細胞外囊泡協(xié)會的建議為檢測 2 個陽性和 1 個陰性指標。

10、準備做細胞外泌體 Small RNA 的 NGS 測序，初始樣品量需要準備多少？

普通腫瘤細胞系推薦使用 40mL 以上的初始樣品量。由于某些細胞（如懸浮細胞、干細胞、 神經細胞等）中外泌體含量比較低，建議先通過 10kD 超濾柱濃縮，準備 40mL 以上的濃縮液 再進行超速離心分離外泌體，一般需提取到 20ng 以上的 Total RNA。

11、進行外泌體 RNA RT-PCR 實驗推薦什么內參？

取決于具體樣品，可以選擇外源添加 cel-miR-39-3p，或內源 U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72 作為內參。

12、提取的外泌體進行 Western blot 前是否需要加入 RIPA 試劑裂解？

需要，一般按照 1:1 的比例加入 RIPA 試劑。

13、進行外泌體 Western blot 鑒定時有無內參蛋白可供選擇？

無，該檢測屬于定性檢測。

14、組織細胞外泌體如何提取？

無菌環(huán)境下將組織剪成小塊（越小越好），然后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12h；將培養(yǎng)液轉 移至離心管中，于 4℃以 3000g 離心 20 min 去除培養(yǎng)液中雜質和細胞碎片，將上清液轉移 至新的離心管中；先使用 0.45μm 濾器過濾上清液，接著使用 0.2μm 濾器過濾上清液，再 進行超速離心分離外泌體。有條件的話建議采用 Transwell 小室培養(yǎng)的方式，效果更佳。

參考文獻