如何獲取可靠的外泌體？

外泌體為何物?相信看過外泌體科普文的童鞋們都已經很熟悉了，在此小編就不再贅述，這里主要針對外泌體的進展及獲取兩方面談談個人觀點。

在剛剛過去的2020年，盡管科學研究受新冠疫情影響，但外泌體研究領域仍然取得了諸多進展。據統計，在基礎研究方面，2020年外泌體領域發表文獻約4000多篇，較2019年發表數量增長27%;在藥物開發領域，相比于細胞療法，外泌體治療獨特的優勢為當前一些難治疾病的治療或者難以成藥靶點的藥物開發帶來一些新的機會。

一方面，外泌體代替細胞治療，避免了細胞治療帶來的免疫排斥和致瘤爭議;另一方面，外泌體膜表面組織特異性抗原的表達為器官、組織、細胞靶向性的藥物開發提供了生物學基礎。復雜的膜組分可以讓外泌體通過表面的蛋白相互作用，或者進入靶細胞來發揮作用，這使得藥物的作用方式更加多元化。另外，外泌體的免疫原性很低，可以重復給藥，且外泌體可以無創性地通過許多組織屏障(例如血腦屏障等)。

隨著外泌體研究與產業化應用的日益火爆，外泌體需求與日俱增。除了依靠自己制備之外，市場上提供外泌體制備服務的公司也如雨后春筍般不斷涌現。如何獲取一款適合自己應用所需且純度高的外泌體就成了一道難題。以下，就如何選擇適合自己的可靠外泌體談談個人看法。

外泌體研究與應用路線圖

一、看外泌體來源

要根據個人研究或使用需求選擇合適來源的外泌體。

外泌體的細胞來源非常之廣泛，包括幾乎所有種類的細胞都會分泌外泌體，但不同來源的外泌體具有不同功能。例如，間充質干細胞來源的外泌體也具備了很多間充質干細胞的功能，比如血管新生、組織修復、免疫調節功能等;神經干細胞來源的外泌體可能更能促進神經再生;而腫瘤細胞分泌的外泌體則在腫瘤的生長、轉移和腫瘤微環境調節過程起著重要作用。我們可以根據自己的應用方向和需求選擇合適的外泌體來源。

二、看外泌體純化方式

外泌體的提取方法有多種：包括傳統的差速離心、密度梯度離心，以及后來發展的超濾法、聚合物沉淀法、免疫分離、隔離篩選法、體積排阻色譜法等。這些方法各有利弊。

外泌體純化的方式多種多樣，目前存在的主流方式主要包括超速離心法、基于PEG-base沉淀法開發的試劑盒提取方式、磁珠免疫法、超濾離心法等等。這幾種外泌體提取的方法各有優缺點。下圖是試劑盒提取外泌體以及超速離心提取的外泌體幾種指標的鑒定比較。

超速離心是從生物體液或細胞上清分離外泌體的金標準方法。采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。目前在國外的重要期刊如Cell、Nature、Science以及其眾多子刊中，超速離心是普遍應用的經典技術手段。

實驗結果表明超速離心獲取的外泌體純度更高，均一性更好，具有更小的粒徑，但相對于PEG-base沉淀法，超速離心法的產量不高。二者都是實驗室常用的外泌體提取方法，小編認為，我們可以根據各自的實驗或應用的需求選擇相應的方法，例如對于分子機制研究或載體的應用，建議使用超離法提取外泌體，獲取更高純度的外泌體，以減少雜質對應用結果的干擾。

四、外泌體三大質檢驗證，符合鑒定“金標準”???

外泌體經細胞分泌后存在于體液或者血液中，故外泌體的制備與提取一般為血液（全血、血漿）、體液（尿液、唾液、腦脊液、羊水、唾液等）、細胞上清液。

國際細胞外囊泡學會于2014年發布的一個指導性聲明文件，文件指出了目前研究和定義細胞外囊泡及其功能所需要的最少實驗要求。這個聲明文件發表在《細胞外囊泡雜志》上。目前該聲明正在籌劃更新。

據國際細胞外囊泡學會（ISEV）在2014年的提議，外泌體鑒定分為三個層面：透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）、Nanosight粒徑、蛋白標志物。

NTA粒徑分析

納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA）是對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，結合Stockes-Einstein方程式計算出納米顆粒的流體力學直徑和濃度，檢測10nm–1000nm 范圍內的顆粒。NTA技術已被外泌體研究領域認可為外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式，NTA技術的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態、檢測速度更快。

外泌體電鏡分析

雙層囊膜結構（茶托狀）是外泌體重要標志之一，但普通光學顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結構。而透射電子顯微鏡?(Transmission electron microscope, TEM)?分辨率可達0.1 – 0.2 nm，可將被觀察物體放大至數百萬倍，是外泌體雙層囊膜超微結構觀測的經典方法。

外泌體標志物鑒定

通過對經典文獻中普遍采用的抗體進行驗證和挑選，優選了多種外泌體標志物抗體，如CD9、CD63、CD81、HSP70、TSG101、Alix等。

五、外泌體的保存及運送? ??

外泌體應低溫保存；短時間（一般1周以內）可放4℃，長時間可放-20℃或者-80℃，并避免反復凍融。

展望：

2013年三位科學家因囊泡運輸調控機制獲得諾貝爾獎后，相關領域的研究迅速成為熱點。特別是近幾年外泌體相關基金和文章屢創新高，全球科研大咖紛紛扎堆此領域，有關外泌體載藥、診斷、預后監測、免疫療法等方向的文章陸續發表在 Cell、Nature 等各大頂級期刊上。外泌體已成為生命科學/臨床醫學研究的一大熱點。目前該領域累計已經發表了8,000余篇Medline論文，而我國的外泌體領域研究更是如火如荼，國自然資助項目數量均呈現井噴式增長，2019年外泌體國自然項目資助數達581項，總金額達2.45億。外泌體的研究領域十分廣泛，除了癌癥領域，在神經系統疾病、心血管等領域也均有研究進展。在此背景下，外泌體研究必然是醫生科學家切入的最好時機。

參考文獻：

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