外泌體提取分離的12種技術

外泌體是直徑在30~150 nm之間的細胞外囊泡，是細胞間通訊的重要介質，與某些疾病的進展密切相關。因此，外泌體被認為是診斷特定疾病的有前途的生物標志物，因此，基于外泌體的治療正在被廣泛研究。對于外泌體相關研究，快速、簡便、高純度、回收率高的分離方法是外泌體在醫療實踐中大規模應用的首要前提。

外泌體是細胞外囊泡（EVs）的主要亞類之一，幾乎所有類型的細胞都會分泌外泌體，廣泛存在于體液中。它們可以攜帶特定的信號分子介導細胞間通訊，調節受體細胞的生理和病理狀態，參與多種疾病的發生和發展。因此，外泌體可作為某些疾病的診斷生物標志物。最近，基于外泌體的無細胞療法引起了醫學界的極大興趣，外泌體作為藥物遞送系統的研究也引起了許多研究人員的極大關注。

外泌體的主要分離提取技術

1.超速離心 (UC)——一種主動分離方法

超速離心是分離不同生物成分最常用的方法，被認為是外泌體分離的經典方法。可分為密度梯度超速離心和差速超速離心（DUC）。

1.1差速超速離心

DUC 是最早和最常報道的外泌體分離策略。操作步驟如下圖所示。該方法過程簡單，不引入其他標記，適用于大劑量樣品分析。然而，鑒于細胞外液具有高度異質性，DUC 可導致非理想的外泌體聚集; 因此，它可能不是一種合適的外泌體純化方法，因為大小相似的不同囊泡和蛋白質聚集體可以在 100,000 × g 下共同形成。因此，應進一步純化使用該方法制備的外泌體。此外，離心力會導致外泌體結構的破壞，進而影響下游實驗，特別是外泌體的功能分析。

基于差速超速離心的外泌體分離示意圖。差速超速離心是通過離心力在 300 × g 到 100,000 × g 范圍內的多循環離心來進行的。通過控制不同的離心力和時間段，依次去除細胞、細胞碎片和凋亡小體。最后一次離心（即 100,000 × g）后，通過去除上清液收集外泌體。離心機在 4 °C 下運行

1.2密度梯度超速離心

密度梯度超速離心是一種基于DUC的改進技術，它是將樣品顆粒加入具有密度梯度的惰性介質（如蔗糖和氯化銫）中，從而利用顆粒密度與媒介。不同的粒子在一定的相對離心力的作用下，集中在梯度介質中的特定位置。最后，獲得不同的區域，以便可以從不同的區域收集各種高純度顆粒。該方法適用于沉降系數略有差異的顆粒的分離。鑒于不同細胞外成分之間固有的密度差異，使用該方法可以獲得更純化的外泌體 。步驟如下圖所示。

基于梯度密度超速離心的外泌體分離示意圖。A等密度密度梯度超速離心。B移動區梯度超速離心

該技術可以分離沉降系數較差的顆粒，如DUC，也可以分離具有一定密度差的顆粒。粒子保持活性，不會擠壓或變形。

但該方法需要配制惰性梯度介質溶液，時間長，操作相對繁瑣。此外，鑒于此方法完全依賴于密度差異，因此不能從具有與外泌體相似的浮力密度（但大小不同）的 EV 中分離外泌體。為了有效解決這一技術問題，研究人員使用了移動區密度梯度離心法，它根據密度和大小分離顆粒。它用于分離具有不同大小和形狀但具有相似密度的顆粒。如圖3B所示, 當樣品通過密度梯度區時, 隨著密度的增加, 密度越高的粒子越快通過梯度層到達管底。

因此，離心過程中的所有溶質都會根據密度和質量/大小順序分離。這反過來又允許分離具有相同密度但不同大小的囊泡。然而，為了獲得最佳的外泌體分離，當區域之間的距離達到最大時應立即停止離心，或者應在管底部安裝高密度培養基作為緩沖液。否則，密度相似但沉降系數大不相同的顆粒會集中在同一區域。

2.超濾 (UF)——一種被動隔離方法

UF 的主要原理涉及使用具有指定孔徑或截留分子量 (MWCO) 的膜來分離預定尺寸范圍內的顆粒。因此，它是一種基于尺寸的隔離技術。基于這一原理，兩種類型的超濾裝置得到了很好的發展：串聯配置的超濾和順序超濾。

外泌體回收率取決于過濾器的類型。在之前的研究中，觀察到孔徑為 10 kDa 的纖維素膜具有最高的回收效率 。UF 可以大大縮短處理時間并且不需要特殊設備。

基于超濾的外泌體分離示意圖。串聯配置的超濾。當生物流體通過兩層膜時，包括細胞碎片、凋亡小體和細胞在內的大囊泡被困在 200 nm 的膜中，而直徑在 20-200 nm 范圍內的囊泡則保留在下方 20 nm篩選。B連續超濾。較大的顆粒（例如，細胞或細胞碎片）首先通過 1000 nm 過濾器去除；然后將濾液通過第二個過濾器，截留值為 500-kD，以去除游離蛋白質；最后，通過 200 nm 過濾器從濾液中收集直徑在 50-200 nm 范圍內的外泌體。C切向流過濾

然而，膜堵塞是一個值得注意的問題，它會縮短昂貴膜的使用壽命并導致效率低下。切向流過濾 (TFF) 技術提供了一種理想的解決方案。TFF為錯流過濾形式。切向流分量破壞了濃差極化層的形成，可顯著降低滲透通量。鑒于膜始終處于平行流動力下，可以有效地減少潛在的堵塞。

此外，TFF 可以提高外泌體的產量和生物活性，而沒有任何來自雜質的副作用。?此外，TFF 表現出比傳統分離方法更好的批次間一致性。除了孔隙堵塞外，UF 的另一個限制對應于與外泌體大小相當的納米粒子的共存。解決此問題的可行方法是將 UF 與其他方法相結合。

3.體積排阻色譜法 (SEC)——一種被動分離方法

SEC 使用初始生物流體作為流動相，使用多孔凝膠過濾聚合物作為固定相。固定相的性質允許不同的洗脫：首先洗脫較大的顆粒。它們之后是較小的囊泡，然后是非膜結合蛋白（因為較大的顆粒可以通過較少的孔，它們通過較短的路徑到達柱的末端并更快地洗脫）。因此，不同階段的洗脫液含有不同大小的顆粒。

與 DUC 相比，SEC 具有某些顯著優勢。首先，SEC 已被證明在分離外泌體的純度方面優于其他技術，這主要是通過改善蛋白質污染來實現的。其次，它可以保持分離的外泌體的完整性和天然生物活性。這可能是因為 SEC 不依賴離心力，這與 DUC 形成了鮮明的對比。第三，SEC 適用于小樣本量，據報道低至 15 μL。第四，SEC 在時間和精力方面是高效的，整個過程可以在短時間內（15 分鐘）完成 。第五，與 UF 方法類似，所用材料的不同孔徑可以產生特定的 EV 子集。最后，SEC的非接觸策略（溶質不與固定相相互作用）比 UF 更有效，從而確保沒有或最小的樣品損失 。

鑒于這些優勢，SEC 最近被認為是從血漿中分離形態和功能完整的外泌體的最佳方法。重要的是，該方法易于擴展和自動化，可用于高通量外泌體的制備。

SEC 有幾個缺點。首先，SEC 無法避免類似大小的污染物的存在。為了消除這些污染物，科學家Gardiner 提出了一種結合 UF 和 SEC 的外泌體分離策略。后來，研究證實了該策略的可行性。其次，從 SEC 中分離出來的總收益很低。但是，可以擴展 SEC 隔離。為了避免這個問題，將SEC與DUC結合使用可以明顯減少外泌體損失，保證產量，并有效去除雜質蛋白，更適合目標蛋白質組學和RNA分析。

4.聚合物沉淀法——一種主動分離方法

聚合物可以通過劫持外泌體周圍的水分子來創造疏水微環境，從而迫使外泌體在低速離心下離開溶液和沉淀物。目前，常用的聚合物有聚乙二醇（PEG）、凝集素、魚精蛋白和乙酸鈉。

基于聚合物沉淀的外泌體分離示意圖

與超速離心或 SEC 相比，該方法具有簡單、可擴展、產量高、外泌體不變形等優點，無需額外設備即可用于大量樣品。

此外，它還可以通過集成各種檢測平臺進行外泌體（或蛋白質/遺傳物質含量）分析，從而用于快速診斷疾病。這些優點表明該方法對未來的臨床研究具有潛在的優勢。

然而，聚合物獲得的外泌體純度較低，這主要是由于可溶性非外泌體蛋白、病毒粒子、免疫復合物和其他污染物的共沉淀。

目前，外泌體的定量通常取決于測試樣品的總蛋白質含量。因此，鑒于蛋白質污染物的存在，該方法不可避免地會導致外泌體制劑的定量錯誤，并影響下游分析。因此，它不被認為是外泌體描述性或功能分析的合適方法。

5.免疫親和捕獲——一種基于標記的分離方法

一些特定的蛋白質、脂質和多糖存在于外泌體表面，它們普遍存在于所有外泌體中；因此，可以根據抗原-抗體特異性識別和結合的原理分離外泌體。

為了根據免疫親和力有效分離外泌體，必須將抗體固定在固體表面上。因此，磁珠是最常用的。

基于磁珠的外泌體分離示意圖

與超速離心相比，通過免疫親和技術分離的外泌體含有至少兩倍數量的外泌體標記物和蛋白質，表明通過這種方法分離的外泌體表現出更高的特異性和產量 。

相反，這種方法通常會導致“偏向”分離，例如，分離 CD9 +外泌體也會導致排除 CD9 -外泌體，從而降低產量。

此外，分離的外泌體表現出更高的純度，這種“偏向”分離有利于親本細胞的研究，可為某些特定疾病的診斷提供重要指標。

其中，最典型的方法是通過檢測 EpCAM 陽性外泌體來評估上皮細胞粘附分子 (EpCAM) 相關癌癥的存在。

通常，使用抗體可以縮短分離時間，提高外泌體的純度，并能夠獲得特定的外泌體成分。

然而，分離效率與抗體的特異性和質量有關，因為大多數用于免疫沉淀的市售抗體都是非特異性的。

因此，外泌體非特異性吸附在固相上。此外，非中性 pH 值和非生理洗脫緩沖液（用于分離外泌體和抗體）可以不可逆地影響收集的外泌體的生物學功能。盡管這些外泌體通常可用于診斷目的，但它們不利于基于外泌體的功能研究和各種治療應用。

此外，它只能適用于小樣本研究，因為需要更昂貴的抗體來解決大樣本問題，這在一定程度上限制了它的大規模使用。為解決這些問題，一種可行的方法是將免疫親和作為附加步驟與 DUC 結合使用，以提高分離的外泌體的純度。

6.基于適體的方法——一種基于標記的分離方法

適體是短的單鏈 DNA 或 RNA 序列，可以以類似于抗體的方式以高親和力和特異性識別并結合其靶標。與傳統抗體相比，適配體可以通過體外化學合成生產，并具有多個優點，例如批次間差異小、免疫原性低或無免疫原性、成本低以及易于化學修飾 。

因此，它們可以用作抗體的替代品。2021 年，研究人貞提出了一種電化學微適體傳感器，可以實現對癌細胞外泌體的靈敏、特異和可靠的檢測，并通過引入抗 EpCAM 適體來定量評估外泌體濃度 。

在過去的幾年中，已經開發了幾種適體介導的外泌體分離平臺。因此，我們認為適體介導的外泌體分離在各種應用中具有巨大的潛力。

7.基于流體特性的微流控技術

微流控技術是一種高通量方法，與多種外泌體分離方法兼容。重要的是，微通道可以根據特定要求連接在一起。微流體裝置具有幾個優點。

首先，它消耗更少的樣品體積、試劑和分離時間。其次，當與其他外泌體分離方法相結合時，它可以協同提高外泌體的產量和純度。然而，某些相關的未解決問題仍然存在。首先，用于分析的樣品會阻塞通道。其次，由于樣本量小，外泌體的產量也很低。此外，該方法需要先進的設備，限制了其大規模應用。

8.基于尺寸的微流控分離技術——一種被動和無標記的分離方法

迄今為止，已經開發了幾種用于外泌體分離的基于尺寸的微流體裝置。第一個設備對應于外泌體總隔離芯片 (ExoTIC) 。它是由不同孔徑的膜組成的模塊單元。可以連接多個模塊單元以分離特定大小范圍的外泌體。ExoTIC結構簡單，使用方便，對天然外泌體結構影響小。

該系統可實現高回收率和分離純度，樣品量小（10-100 μL），適用于臨床檢測。第二個裝置對應于基于納米線的外泌體行程系統。該設備可以以 60% 的回收率分離外泌體 。

2020 年，研究人員提出了一種具有高靈敏度和特異性的集成微流體裝置，用于分離和檢測外泌體。該裝置的原理涉及通過不同外泌體的離子濺射金層來調節膜孔徑大小。雖然基于尺寸的微流控分離技術（類似于SEC）可以實現高通量，但純度有待進一步提高。

用于 EV 隔離的 ExoTIC 設備示意圖。A可以處理各種生物流體。B ExoTIC 設備示意圖。完整的 EV 在過濾器中富集和純化，而游離蛋白質和核酸被洗掉。C孤立 EV 的下游分析。D從采樣到 EV 輸出的 EV 隔離示意圖。5–10 mL 樣品的總操作時間低于 3 小時。E ExoTIC 設備的設計示意圖。F實際模塊化 ExoTIC 設備的圖像。它由 5 個模塊組成，每個模塊具有不同的膜孔徑，串聯連接以隔離 EV。

用于外泌體分離和檢測的集成微流體裝置。a 集成微流體裝置的設計。b 原位檢測外泌體的示意圖。c 集成微流體裝置的照片。d 沉積在厚度為 50 nm 的 AAO 膜上的納米多孔金 (Au) 納米粒子的 SEM 圖像。e , ?f Au 涂層的側視圖。g形成的復雜納米多孔金納米團簇 (AuNC)-Exosome-AuR 的 SEM 圖像。

9.確定性橫向位移 (DLD) 技術——一種被動且無標記的隔離方法

DLD 裝置主要由具有特定臨界尺寸的圓柱形梯度陣列組成，用于粒子隔離。DLD 的原理涉及改變大于臨界尺寸的粒子的流動路徑而不影響其他粒子的路徑。

2014 年，科研人員開發了一種 DLD 微流體裝置，可用于從不同的癌細胞衍生 EV（包括外泌體）群體中分離微泡。2016 年，科學家Wunsch 等人。首次設計了納米級 DLD 陣列。重要的是，使用該設備成功分離了外泌體，證明了其在外泌體芯片分選和定量方面的潛力。最近，DLD 已被用作一種無標記且易于使用的技術，用于分離微流控芯片中的外泌體。然而，當前基于尺寸的技術仍然受到外泌體飽和度和低回收率的限制。此外，由于堵塞的風險，它提出了低純度的挑戰。

10.免疫微流控技術——一種基于標記的分離方法

類似于基于免疫親和力的外泌體分離的一般方法，外泌體是通過固定在微流體裝置（也稱為芯片）上的抗體與外泌體標記物的特異性結合來分離的。該技術的優點包括效率高、處理速度快、操作簡單和樣本量小。因此，它引起了外泌體研究的極大興趣。

然而，該方法獲得的外泌體的完整性和純度有待提高。非特異性結合是微流體免疫親和分離中的另一個問題，因為封閉和洗滌步驟不能在微流體裝置中進行。納米技術為解決這個問題提供了寶貴的機會。

2014 年，科學家Ramanathan 等人，提出了一種微流體系統，與流體動力流體流動相比，其捕獲和檢測性能提高了五倍，并且這種方法展示了適用于基本上任何基于免疫捕獲的生化測定的潛力。研究人員使用慣性操縱涂有拮抗劑的磁珠來實現高信噪比的外泌體分離 。另一種解決方案涉及使用單克隆抗體來減少非特異性結合。此外，與抗體結合的外泌體最終應通過溶解在酸性溶液中釋放，這會污染收集到的外泌體，從而影響其下游應用。一種可能的解決方案包括允許在中性溶液中釋放外泌體。2021 年，科學家Suwatthanarak 等人，使用 NaCl 溶液釋放捕獲的外泌體，這在下游 miRNA 分析中顯示出完整性。

11.介電泳 (DEP) 技術——一種主動且無標記的分離方法

在非均勻電場中，粒子被極化并受到與其大小（與其半徑成反比）和電氣特性相關的介電力的作用。因此，在此電場下，較小的顆粒可以通過方形電場的較大梯度捕獲（反之亦然），并且可以實現尺寸依賴性外泌體分離 。

2017 年，研究人員使用交流電動微陣列芯片從未稀釋的血漿中快速分離膠質母細胞瘤外泌體。此方法所需的樣品可低至 30 μL，外泌體可在 30 分鐘內分離。2019 年，科學家Ayala-Mars 等人，設計了一種基于直流絕緣體的介電泳方法，可以根據大小同時捕獲和分離外泌體。2020 年，Stanley 等人，基于低電導率和高電導率介質中的 DEP 力和電流體動力阻力設計了一種獨特的微流體裝置，可以從生物體液中分離出高質量和高純度的納米粒子，例如外泌體。

2021 年，科研人貞開發了一種用于外泌體分離和檢測的微流體裝置（ExoDEP-chip）。首先通過與預固定在聚苯乙烯 (PS) 微球表面上的抗體結合來分離外泌體。然后，單個微球在 ExoDEP 芯片的 DEP 力作用下被捕獲到單個微孔中，實現了微球介導的 DEP 分離和免疫親和檢測。該方法具有檢測限低、檢測范圍大的特點，還實現了對不同細胞系的蛋白質分析。然而，鑒于焦耳熱 (JH) 和電熱加熱效應，必須采用良好的電極設計以避免它們對隔離性能的影響 。

目前，一些報告檢測了基于 DEP 技術的外泌體分離，這主要是由于分辨率低和純度低。此外，外泌體功能的完整性仍有待探索。因此，進一步的體外研究和下游分析，如 RNA 測序和蛋白質組學分析，是必要的。然而，基于DEP的方法具有無標記、非接觸、快速、高通量等特點，具有良好的應用前景。

ACE 設備（芯片）微電極上外泌體隔離的示意圖。電場線（藍色）在微陣列上的各個微電極之間運行并會聚到微電極的邊緣，從而形成 DEP 高場區域。外泌體聚集在高場區域，而樣品中的細胞或較大顆粒則集中在微電極之間的 DEP 低場區域，而較低分子量的生物分子不受 DEP 電場的影響。流體清洗可去除任何細胞和其他血漿材料，而納米級生物標志物（外泌體等）仍集中在 DEP 高場區域。