火爆全球的——外泌體!干細胞技術(shù)的下一個發(fā)展方向。（附提取方式分析）

1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。

發(fā)現(xiàn)之初，這種物質(zhì)一直被當(dāng)作細胞的廢棄物。而現(xiàn)在，外泌體作為細胞間通信載體的作用已被科學(xué)界普遍接受。

?

外泌體是一種能被大多數(shù)細胞分泌的微小膜泡，直徑約 30-150nm，細胞經(jīng)過“內(nèi)吞融合-外排”等一系列調(diào)控過程而形成細胞外納米級小囊泡。外泌體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、 脂類、和復(fù)雜 RNA( mRNA, ncRNA, miRNA, rRNA )，表面有特異性蛋白。外泌體天然 存在于各種體液中，如外周血、 唾液、尿液、腹水、羊水、腦脊液、乳汁等。

外泌體從 發(fā)現(xiàn)至今已有 30 多年的歷史，最初被認為是細胞的“垃圾”，此后發(fā)現(xiàn)，外泌體是具有功 能活性并可進行細胞間信息傳遞的分泌微囊泡。2013 年的諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎授予美國 科學(xué)家詹姆斯·羅斯曼、蘭迪·謝克曼和德國科學(xué)家托馬斯·蘇德霍夫，以表彰他們在發(fā)現(xiàn) 細胞囊泡運輸系統(tǒng)及其運行調(diào)節(jié)機制研究中做出的杰出貢獻。這種細胞外囊泡樣結(jié)構(gòu)就 是外泌體。

?

可以將脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和DNA等生物分子從一個細胞傳遞到另一個細胞，從而交換遺傳信息、重編程宿主細胞，進行細胞間通訊。

?

生物界的郵差

?

人體內(nèi)多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，包括干細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、血小板及平滑肌細胞等

?

外泌體被包裹在堅硬的雙層膜中。雙層膜保護外泌體的內(nèi)容物，使外泌體能夠在組織中長距離移動。干細胞外泌體因在上皮組織的增殖、遷移、再生、炎癥和瘢痕控制等方面的作用，有望成為“無細胞的細胞治療”工具。

開發(fā)高效、快速、穩(wěn)定，并且保持外泌體結(jié)構(gòu)和生物功能完整性的方法，是目前外泌體應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)和前提。從細胞上清和體液中提取分離外泌體的方法很多，但是外泌體的純度和產(chǎn)量卻和分離方法息息相關(guān)。通常分離步驟少、產(chǎn)率高，但是純度會受到影響。鑒于每種分離方法都有其優(yōu)缺點，實驗可以根據(jù)樣本來源、下游實驗?zāi)康牡龋x擇合適的外泌體分離方法。2015年，國際囊泡組織(Internation Society for Extracelluar Vesicles, ISEV)指出，簡單依靠一種分離方法得到的外泌體的純度和產(chǎn)量都難滿足實驗的需求。因此，推薦聯(lián)合使用各種方法，從而得到高純度和高產(chǎn)量的外泌體。本文總結(jié)了常用的傳統(tǒng)和新興的外泌體提取方法。

?

一、超速離心法

常用的是超高速離心法，該方法是被譽為分離外泌體的“金標準”。該方法利用離心力從細胞培養(yǎng)液或生物流體獲得外泌體，經(jīng)過400×g、2000×g、10 000×g的低速離心，除去細胞及大的細胞分泌物；最后超高速100 000×g離心得到外泌體。超高速離心因操作簡單，不需要復(fù)雜的技術(shù)支持，并且成本相對較低而被廣泛使用。但是該方法耗時、產(chǎn)率低，得到的外泌體的數(shù)量和質(zhì)量很大程度上受轉(zhuǎn)子的類型、轉(zhuǎn)子沉降角度等因素影響，其中最主要的問題就是差速離心法獲得的沉淀物是外泌體，但也會有其他的囊泡、蛋白質(zhì)或蛋白和RNA的聚集體。

二、密度梯度離心法

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的密度在1.1~1.19 kg·L之間，因此，可以采用密度梯度離心法來分離外泌體。該方法是將超速離心結(jié)合蔗糖密度梯度或蔗糖墊結(jié)合，原理是先除去非囊泡物質(zhì)，再通過梯度密度濃縮提取外泌體，該方法可以得到相對較為純凈的外泌體。傳統(tǒng)的梯度密度方法通常需要離心16 h，但是2012年，研究者使用了62~90 h才分離出某些確切囊泡，因此，該方法可能不足以沉淀所有的外泌體。如果離心時間不充足，污染物質(zhì)可能和外泌體保持在相同的密度層，特別是這個密度范圍又比較寬。

三、聚合物沉降法

這種方法是通過高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改變外泌體的溶解性和分散性，使其能夠在比較低的離心力下沉降出來。其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子和PEG本身形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)。這種方法的優(yōu)點就是操作起來比較簡單，不需要超速離心機，得到的外泌體數(shù)量較多，也適合大劑量的樣品處理。但是這種方法提取得到的外泌體，雜質(zhì)含量會比較多，尤其是一些雜蛋白。

四、分子排阻法

這種方法主要是利用多孔的凝膠球，通過分子大小不同將外泌體純化出來，其原理類似層析法純化蛋白。在分離提取過程中，大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔，很快沿多孔凝膠間的縫隙被流動相洗脫出來，而小分子物質(zhì)能進入凝膠孔，滯留時間更長，會更慢地被洗脫出來。外泌體的分子粒徑大于一般的蛋白分子，所以外泌體會先被洗脫下來，而粒徑小的蛋白質(zhì)會被后洗脫下來，從而分離出高純度的外泌體。優(yōu)點就是純度相對較高，且外泌體結(jié)構(gòu)不易受到破壞。缺點就是如果有一些大小相近的顆粒也會被純化出來，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。

五.尺寸排阻色譜法和超濾法

尺寸排阻色譜法是利用分子篩理論，最初是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小分離蛋白質(zhì)的色譜技術(shù)。該方法的主要優(yōu)點是不需要很大的離心力，從而保證了外泌體的完整性。Mol等[13]對比超高速離心和尺寸排阻色譜法得到的外泌體蛋白，結(jié)果顯示，后者得到的外泌體的蛋白豐度高于前者。這些基于過濾或尺寸排阻色譜的新方法為外泌體大規(guī)模的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了可能。

超濾也是根據(jù)外泌體的尺寸將其分離出來的一種方法，超濾一般被認為是外泌體分離過程中的一個準備過程，通過超濾除去大分子和小分子的蛋白質(zhì)。不過連續(xù)的超濾可以分離出外泌體，和超高速離心相比，超濾不需要特殊的設(shè)備就可以較短時間內(nèi)分離出外泌體。但是，超濾膜對外泌體的黏附作用會降低外泌體的產(chǎn)量，并且超濾過程中施加的外力可能會使外泌體變形或者破裂。

六.磁珠特異性捕獲法

外泌體表面帶有許多特殊的膜蛋白質(zhì)，如CD9、CD63、CD81和ANNEXIN等，可以將這些外泌體標志蛋白作為分離外泌體的特異性標記。將抗體固定于磁珠等基質(zhì)上，利用相應(yīng)性抗體與這些標志蛋白之間的特異性相互作用，以實現(xiàn)對外泌體的特異性富集。這種方法的優(yōu)點是外泌體純度較高，并且對外泌體膜結(jié)構(gòu)影響較小。缺點就是成本較高，無法進行大劑量的提取，并且磁珠保存難度也比較高。

外泌體作為“貨物”載體

?

外泌體的脂質(zhì)雙分子膜可以保護其在血液循環(huán)中不被降解，但是這種膜結(jié)構(gòu)以及其內(nèi)含各種豐富的物質(zhì)，使得外泌體載“貨物”變得困難。外泌體只有保證膜結(jié)構(gòu)的完整性，才能不引起免疫反應(yīng)，不被MPS吞噬。目前，將“貨物”載入外泌體的方法主要有兩種(Fig 4)：(1)前轉(zhuǎn)載，在分離外泌體之前，將“貨物”與母代細胞共培養(yǎng)和對母代細胞進行轉(zhuǎn)染，可以讓母代細胞分泌含有“貨物”的外泌體；(2)后轉(zhuǎn)載，分離出外泌體之后，將“貨物”載入外泌體。

美國抗衰老和再生醫(yī)學(xué)學(xué)會主席Ronald Klatz博士曾說：“許多科學(xué)家現(xiàn)在相信外泌體是干細胞技術(shù)的下一個發(fā)展方向”。