再生醫(yī)學(xué)材料的黃金搭檔：外泌體與細(xì)胞外基質(zhì)

圖 1?外泌體的生物來(lái)源過(guò)程和結(jié)構(gòu)

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圖 2?外泌體從核內(nèi)體和質(zhì)膜中萌發(fā)

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所有的細(xì)胞都可以分泌外泌體，機(jī)體的體液內(nèi)和間質(zhì)中均含有大量的外泌體。由于生物體內(nèi)所含有的細(xì)胞或者蛋白非常豐富，因此從體內(nèi)提取外泌體是非常困難的，而且外泌體來(lái)源的細(xì)胞也無(wú)法確定。

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近年來(lái)，來(lái)自干細(xì)胞的外泌體引起了科學(xué)家們的關(guān)注。干細(xì)胞具有特殊的分化潛能，因此在醫(yī)用再生領(lǐng)域被廣泛研究，并應(yīng)用于不同的組織修復(fù)和再生中。而近期科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞在組織再生中，相較于其自身的分化潛能，可能更多是通過(guò)旁分泌作用調(diào)控了組織微環(huán)境以及其他細(xì)胞的行為。其分泌的外泌體，正是非常重要交流介質(zhì)，起到干細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的溝通交流。于是，科學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)大量的干細(xì)胞，進(jìn)而提純并收集外泌體，再研究其在組織修復(fù)以及疾病中的應(yīng)用。

現(xiàn)如今有兩類(lèi)廣泛使用的用于提純外泌體的方法：超速離心法和Thermo Fisher等公司生產(chǎn)的提純?cè)噭┖小?/span>

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超速離心法，主要是通過(guò)將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)干細(xì)胞所得到的培養(yǎng)基通過(guò)濾膜濾掉尺寸較大的細(xì)胞碎片及細(xì)胞外囊泡后，通過(guò)超速離心機(jī)在100,000g的離心力的作用下富集得到外泌體。

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提純?cè)噭┖校饕峭ㄟ^(guò)試劑包被外泌體，使其尺寸和重量增大，從而在10,000g的離心力即可得到外泌體。試劑盒的使用有導(dǎo)致外泌體污染的風(fēng)險(xiǎn)，在科研領(lǐng)域超速離心法更為常見(jiàn)。

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由于外泌體在再生醫(yī)美領(lǐng)域顯示出極大前景，這也迎來(lái)產(chǎn)業(yè)化合作的新浪潮，眼下外泌體似乎已經(jīng)成為下一個(gè)生物醫(yī)藥的黃金賽道。科學(xué)家們普遍認(rèn)為，外泌體具有其獨(dú)特的生物學(xué)特征，可以反映來(lái)源細(xì)胞的表型。

圖 5?外泌體促進(jìn)皮膚修復(fù)

不同細(xì)胞分泌不同的外泌體，因此外泌體的應(yīng)用是多種多樣的。一方面，外泌體被認(rèn)為是多種癌癥的疾病診斷生物標(biāo)志物。外泌體獨(dú)特的miRNA譜圖和疾病載體作用，使得其頻繁出現(xiàn)在卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌。另一方面，外泌體也可以作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的有效媒介而廣泛用于醫(yī)學(xué)再生領(lǐng)域。例如，它們能夠?qū)NA和蛋白質(zhì)的信息從來(lái)源細(xì)胞轉(zhuǎn)移到周?chē)h(huán)境中的其他細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，來(lái)自小鼠胚胎干細(xì)胞的外泌體在體外促進(jìn)了小鼠造血干細(xì)胞的存活和擴(kuò)展，同時(shí)也上調(diào)了受體細(xì)胞中與多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。干細(xì)胞來(lái)源的外泌體與生物材料相結(jié)合，促進(jìn)骨組織以及關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生。

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在皮膚組織再生中，外泌體的應(yīng)用尤其廣泛。如脂肪源外泌體能通過(guò)減少I(mǎi)FN-α的分泌而發(fā)揮免疫抑制作用，從而抑制T細(xì)胞的激活。此外，外泌體含有免疫調(diào)節(jié)蛋白如TNF-α、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），從而通過(guò)良好的炎癥調(diào)節(jié)保證了傷口愈合。而在皮膚愈合過(guò)程中，外泌體則能通過(guò)優(yōu)化成纖維細(xì)胞特性加速皮膚傷口愈合。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體上調(diào)199個(gè)miRNA，下調(diào)93個(gè)miRNA，促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞增殖和分化，加速皮膚再生。

總而言之，干細(xì)胞來(lái)源的外泌體作用廣泛。在皮膚再生中，外泌體可以通過(guò)調(diào)控炎癥、促進(jìn)皮膚修復(fù)等多方面提供作用；在疾病發(fā)展中，外泌體也參與多種病理通路。在未來(lái)，無(wú)論是組織再生、皮膚修復(fù)、還是疾病研究，外泌體都將在其中扮演重要角色。

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外泌體具有諸多優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)用再生中具有難以忽視的價(jià)值。然而，外泌體的應(yīng)用卻還有所局限。

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最適用于提純外泌體的超速離心法，在提純得到外泌體的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致大量的外泌體損失，至少80%的外泌體會(huì)因?yàn)槭占膿p失或者在超離過(guò)程中其獨(dú)特的磷脂雙分子層的膜破碎而無(wú)法維持其正常形態(tài)。

此外，外泌體在提純后其保存比較困難，需要保存的試劑具有與體液類(lèi)似的滲透壓從而維持其磷脂雙分子層的膜結(jié)構(gòu)，否則其內(nèi)含的具有生物功能的蛋白質(zhì)和miRNAs也容易失去活性。另外，外泌體起到信號(hào)傳導(dǎo)作用，但本身并不會(huì)提供結(jié)構(gòu)支持。因此，在修復(fù)領(lǐng)域，外泌體難以單獨(dú)使用。

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所有細(xì)胞均可分泌外泌體，外泌體充當(dāng)著細(xì)胞之間信息交流的介質(zhì)，因此外泌體生理功能的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)一個(gè)細(xì)胞“出”而“進(jìn)”入到另一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。在組織內(nèi)部，必然要穿越細(xì)胞外基質(zhì)。

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因此，外泌體更適合作為細(xì)胞外基質(zhì)的一部分來(lái)發(fā)揮價(jià)值，而細(xì)胞外基質(zhì)的獨(dú)特生理結(jié)構(gòu)和生理穩(wěn)態(tài)一來(lái)可以幫助維持外泌體的活性、二來(lái)也能與外泌體協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)更好的修復(fù)和再生效果。

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細(xì)胞外基質(zhì)是外泌體最理想的載體

在醫(yī)用再生領(lǐng)域，科學(xué)家們研究各種各樣的生物材料，并與外泌體進(jìn)行復(fù)合促進(jìn)組織的修復(fù)和新生。細(xì)胞外基質(zhì)無(wú)疑是最安全的并且可以與外泌體協(xié)同發(fā)揮作用的生物材料。細(xì)胞外基質(zhì)本身即源于人體，具有多元的組成（膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白等等）。

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一方面，細(xì)胞外基質(zhì)能夠起到結(jié)構(gòu)支持作用，作為承載材料提供組織再生的根基；另一方面，細(xì)胞外基質(zhì)中復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)可以維持外泌體的活性，從而高效發(fā)揮外泌體的性能。外泌體可以通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其優(yōu)異的生物學(xué)功能，?而細(xì)胞外基質(zhì)作為載體即可以為細(xì)胞的黏附和遷移提供平臺(tái)。如果沒(méi)有細(xì)胞外基質(zhì)所提供的平臺(tái)，那么外泌體會(huì)很快隨著體內(nèi)的生理循環(huán)和代謝而流失，從而失去了其作用效果。眾所周知，外泌體價(jià)格昂貴。當(dāng)外泌體由細(xì)胞外基質(zhì)承載、由細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)時(shí)，才會(huì)更好地提高其生物利用度，取得更好的修復(fù)效果。

圖 7?細(xì)胞外基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)支持和修復(fù)平臺(tái)

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細(xì)胞外基質(zhì)提供適應(yīng)的修復(fù)微環(huán)境

組織修復(fù)和再生，與細(xì)胞微環(huán)境息息相關(guān)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，微環(huán)境由兩個(gè)基本組成部分組成，一個(gè)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），而另一個(gè)是細(xì)胞分泌的外泌體、生長(zhǎng)因子等功能性物質(zhì)。二者缺一不可，彼此相輔相成、緊密結(jié)合。因此，光有外泌體，沒(méi)有細(xì)胞外基質(zhì)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不行的。

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其實(shí)，除去細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)外泌體的負(fù)載和保護(hù)作用，其本身也具備出眾的再生和修復(fù)能力。除了提供細(xì)胞存在的平臺(tái)，細(xì)胞外基質(zhì)的多元組成既可以為細(xì)胞的生理活動(dòng)提供養(yǎng)分，并駐留在原位，成為機(jī)體自身的細(xì)胞外基質(zhì)的一部分；又能夠通過(guò)其本身的生物學(xué)特性來(lái)協(xié)同外泌體，實(shí)現(xiàn)更好的修復(fù)和再生效果。在經(jīng)典的修復(fù)再生過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的表型和表達(dá)，而外泌體則含有控制干細(xì)胞分化的表型特異性指導(dǎo)因子（miRNA，RNA和蛋白質(zhì)）。

圖 8?皮膚修復(fù)與再生

簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞外基質(zhì)可以從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物力學(xué)、功能靶點(diǎn)等多個(gè)維度與外泌體、生物因子共同作用，從而形成適于組織修復(fù)的胞外微環(huán)境。

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首先，細(xì)胞外基質(zhì)所含有的多種蛋白、多糖成分構(gòu)建出其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)和表面拓?fù)鋵W(xué)特征。除支撐組織的生理形態(tài)外，還能夠調(diào)控募集細(xì)胞的黏附、增殖和分化行為。近年來(lái)，人們更是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答等行為息息相關(guān)，進(jìn)而調(diào)控組織再生。

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再者，細(xì)胞外基質(zhì)本身具有其獨(dú)特的生物力學(xué)性質(zhì)。不同彈性模量、不同硬度的基質(zhì)，能夠引發(fā)細(xì)胞的不同表現(xiàn)行為和分化方向，也會(huì)引起細(xì)胞分泌和募集因子的不同。

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細(xì)胞外基質(zhì)極為多元的組成能提供不同的生物學(xué)效果，從而建立修復(fù)微環(huán)境。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白因可與細(xì)胞表面的整合素蛋白的α5β1結(jié)合，充當(dāng)修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)交流溝通的重要參與者，并且調(diào)控細(xì)胞的黏附、增殖、形態(tài)和分化等行為；蛋白聚糖通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的組裝和維持，并通過(guò)與生長(zhǎng)因子的相互作用參與細(xì)胞增殖等細(xì)胞行為，在組織的生理和生物力學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。正是由于細(xì)胞外基質(zhì)打下的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，才能讓外泌體、細(xì)胞因子等活性成分進(jìn)一步“錦上添花”。

圖?9?細(xì)胞外基質(zhì)多作用靶點(diǎn)

另外，近幾年研究中還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)能結(jié)合和錨定多種生長(zhǎng)因子（如VEGF，HGF等）、多肽短鏈。一方面，通過(guò)構(gòu)型調(diào)整來(lái)更好地發(fā)揮其生物活性；另一方面，則能形成生長(zhǎng)因子梯度，從而介導(dǎo)修復(fù)和再生過(guò)程的進(jìn)行。可以想象，這是唯有細(xì)胞外基質(zhì)才能實(shí)現(xiàn)的高度復(fù)雜而有序的生物過(guò)程。相比之下，僅僅使用外泌體完全無(wú)法實(shí)現(xiàn)上述空間上的介導(dǎo)過(guò)程。這也解釋了為何直接使用外泌體或生長(zhǎng)因子時(shí)，往往修復(fù)和再生效果并不如人所愿。

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關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)和外泌體之間的作用，目前依然還在不斷研究中。然而，我們已經(jīng)可以知道的是：細(xì)胞外基質(zhì)是組織再生的舞臺(tái)，而外泌體則是舞臺(tái)上的演員。演員可以讓舞臺(tái)更加熠熠生輝，但舞臺(tái)卻是整個(gè)根基所在。二者有機(jī)結(jié)合，則能帶來(lái)最好的演出效果。

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圖 10?負(fù)載外泌體的ECM再生材料

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隨著技術(shù)的進(jìn)步，外泌體已經(jīng)越來(lái)越被人們熟知，其應(yīng)用也愈加廣泛。外泌體是具有納米尺寸的細(xì)胞囊泡，具有高生物活性，能參與細(xì)胞之間的交流，調(diào)控炎癥水平、促進(jìn)組織再生。然而，外泌體提取較為困難，本身也不具備結(jié)構(gòu)性的功能，因此單獨(dú)使用有所局限。

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作為細(xì)胞外基質(zhì)中的一部分，當(dāng)外泌體回到細(xì)胞外基質(zhì)中時(shí)，能夠發(fā)揮出更為強(qiáng)大的作用，更起到“錦上添花”的效果。細(xì)胞外基質(zhì)一方面是外泌體最理想的載體，幫助維持外泌體的活性；另一方面細(xì)胞外基質(zhì)能夠構(gòu)建出最適宜再生的細(xì)胞外微環(huán)境，從而讓外泌體能更加有的放矢。

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目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究正如火如荼地進(jìn)行中。相信，不久的將來(lái)，細(xì)胞外基質(zhì)/外泌體這樣的明星組合會(huì)越來(lái)越多地出現(xiàn)在我們面前。