綜述 | 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和再生中的研究進展

間充質(zhì)干細(xì)胞

1.1 MSCs的來源：MSCs是一種來源于成體的多能干細(xì)胞，幾乎存在于所有的組織器官中，能分化成多種細(xì)胞類型。目前，MSCs的最廣泛來源是骨髓源性MSCs(Bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs)、脂肪源性MSCs(Adipose tissue-derived MSCs,AT-MSCs)和臍帶源性MSCs(Umbilical cord-derived MSCs,UC-MSCs)。MSCs的另一個重要來源是口腔組織，包括牙髓、牙根尖周炎囊腫、脫落的乳牙牙髓、牙周韌帶、牙囊祖細(xì)胞、牙齒和牙齦的根尖乳頭組織。此外，還可以從羊水、骨膜和胎兒組織中分離出來，這些MSCs顯示表型異質(zhì)性。以及其他一些組織，如血液、肝臟、脾臟和妊娠早期、中期人類胎兒的骨髓中提取。MSCs易于體外分離和擴增，分離后在低溫環(huán)境下冷凍保存，對其生物學(xué)活性不產(chǎn)生影響以及表達(dá)中等或低等水平的MHCI類和MHCII分子，具有低免疫原性等特點。

1.2 MSCs的安全性問題：盡管MSCs在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和再生方面取得了重大進展，但MSCs治療的安全性和有效性一直存在爭議。例如在MSCs的制備過程中要充分了解供者的健康狀況，包括年齡、既往史、家族史等，規(guī)避這些外在的干擾因素，存儲過程要求嚴(yán)格無菌，排除醫(yī)源性導(dǎo)致的感染，以及免疫排斥和腫瘤發(fā)生等風(fēng)險。相反，與MSCs治療相比，MSCs源性外泌體具有以下優(yōu)勢：① MSCs源性外泌體與靶細(xì)胞直接結(jié)合，具有很強的生物學(xué)效應(yīng)；② MSCs源性外泌體可以在-70℃下長期儲存和運輸，其生物活性不易破壞；③ 濃度、劑量、途徑和使用時間易于控制；④ 不存在由細(xì)胞移植治療引起的免疫排斥和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險；⑤ 外泌體可以通過過濾進行滅菌而進入臨床使用。因此，MSCs源性外泌體可以替代MSCs治療，在創(chuàng)傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景和潛能。

MSCs源性外泌體生物學(xué)特性

外泌體的首次發(fā)現(xiàn)早在20世紀(jì)60年代，直至20世紀(jì)80年代后期對于外泌體的研究才有了更多發(fā)現(xiàn)。在羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的研究中，揭示了外泌體形成的機制。外泌體是一些具有生物活性的分子，以微米到納米大小的細(xì)胞外囊泡(Extracellular ?vesicles,EVs)顆粒形式釋放。根據(jù)顆粒大小，EVs可分為外泌體(50～100 nm)、微泡(100～1 000 nm)和凋亡小體（500～5 000 nm）。外泌體的生物合成主要由細(xì)胞經(jīng)胞吞作用分泌，細(xì)胞膜先向內(nèi)出芽形成更大的細(xì)胞內(nèi)囊泡—多囊泡體（Multivesicular bodies，MVBs）,隨后多囊泡體逐漸向細(xì)胞邊緣遷移并與細(xì)胞膜融合，再次向內(nèi)凹陷形成顆粒狀小囊泡—外泌體，最后通過胞吐作用被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。MSCs源性外泌體具有多種特異性標(biāo)記蛋白，包括膜轉(zhuǎn)運蛋白和融合蛋白（例如鳥苷三磷酸和膜聯(lián)蛋白）、四跨膜蛋白（例如CD9、CD63和CD81）、熱休克蛋白（例如hsp60、hsp70和hsp90）、參與MVBs生物合成蛋白（如：腫瘤易感基因101蛋白和Alix蛋白），以及脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶。外泌體是MSCs旁分泌至關(guān)重要的生物活性囊泡，通過影響受體細(xì)胞的存活、增殖、遷移、基因表達(dá)以及重新編程靶向細(xì)胞行為來調(diào)節(jié)許多生理和病理過程，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和再生過程中起重要作用。

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，主要作用是恢復(fù)受損組織的結(jié)構(gòu)和功能。它是一個復(fù)雜而有序的精確調(diào)控過程，包括止血期、炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞遷移增殖期、血管生成和基質(zhì)重塑期。在影響創(chuàng)傷修復(fù)的各種因素中，血管生成占據(jù)關(guān)鍵位置，向創(chuàng)傷部位輸送營養(yǎng)和氧氣，促進成纖維細(xì)胞增殖，膠原蛋白合成和再上皮化。在病理情況下，破壞和延長創(chuàng)傷愈合過程會導(dǎo)致慢性、不愈合的傷口，例如糖尿病傷口。糖尿病傷口愈合不良的機制目前仍不清楚，但是缺氧會造成血管生成受損，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生和神經(jīng)病變損害，導(dǎo)致這些患者長期醫(yī)療負(fù)擔(dān)和生活質(zhì)量受損。在創(chuàng)傷愈合方面，由于MSCs療法能夠募集細(xì)胞，釋放生長因子和蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是一種有前途的細(xì)胞基礎(chǔ)療法。它能夠加速傷口愈合，增加傷口上皮化，肉芽化組織形成，分化為皮膚的血管生成細(xì)胞和修復(fù)受損細(xì)胞。但是，因MSCs的缺點，目前已經(jīng)專注于MSCs源性外泌體，包括細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子和含有mRNA、蛋白質(zhì)和microRNA的細(xì)胞外囊泡，以及他們在傷口愈合過程中的作用。

MSCs源性外泌體在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用機制

創(chuàng)傷愈合過程中的另一個重要信號通路是PI3K/AKT，與Wnt/β-catenin通路平行。Yang等報道hAT-MSCs源性外泌體中的miR-21通過PI3K/AKT信號通路增強基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (Matrix metalloproteinases,MMP-9)表達(dá)并抑制金屬蛋白酶內(nèi)源性抑制劑1(Tissue inhibitors ofmetalloproteinase,TIMP-1)，促進HaCaTs在體外的增殖。此外，miR-126促使磷酸酶和張力蛋白同源物(Phosph atase and tensin homolog,PTEN)下調(diào)，在體外通過PI3K/AKT通路刺激血管生成，有助于刺激創(chuàng)傷愈合和糖尿病大鼠體內(nèi)的血管生成。該通路也被報道在體外經(jīng)過hA-TMSCs源性外泌體處理后，促進成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白沉積，從而促進傷口愈合。Yu等報道通過阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)處理的人BM-MSCs(Human BMMSCs,hBM-MSCs)源性外泌體激活A(yù)KT/內(nèi)皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)信號通路，上調(diào)miR-211-3p，促進內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，加速糖尿病大鼠體內(nèi)傷口的再生。另外，除了AKT，hBM-MSCs源性外泌體還能夠激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3(Activator of transcription 3，STAT3)，促進體外營養(yǎng)因子如細(xì)胞周期蛋白D2表達(dá)。這也刺激體外內(nèi)皮細(xì)胞的成纖維細(xì)胞生長、遷移和血管生成。誘導(dǎo)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(Induced mesenchymal stromal cell,iMSC)源性外泌體也已被證明可以刺激ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而促進HaCaTs和人體內(nèi)真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts，HDF)的增殖。而且，從hBM-MSCs、hAT-MSCs和hUC-MSCs中獲得的外泌體被報道，通過誘導(dǎo)傷口愈合介導(dǎo)的生長因子可促進HaCaT和HDF體外的增殖和遷移。例如，作為血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、成纖維細(xì)胞生長因子2(Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)和血小板衍生生長因子BB(Platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)，可激活A(yù)KT、ERK和STAT3信號傳導(dǎo)。對于ERK蛋白，Wang等報道，hAT-MSCs源性外泌體通過激活ERK/絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase，MAPK)途徑增加皮膚真皮成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinases，MMP3)的表達(dá)，導(dǎo)致MMP3轉(zhuǎn)化成TIMP1，這也利于細(xì)胞外基質(zhì)重塑。這些外泌體還減少了瘢痕的大小并通過在體內(nèi)阻止成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，增加轉(zhuǎn)化生長因子-β₃(Transforming growth factor,TGF-β₃)轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化 生長因子-β₁(Transforming growth factor，TGF-β₁)的比例來增加小鼠傷口中膠原蛋白Ⅲ與膠原蛋白Ⅰ的比例。

關(guān)于無瘢痕傷口愈合，一些研究已經(jīng)關(guān)注到TGF-β/Smad信號通路的作用。例如，Jiang等表明hBM-MSCs源性外泌體在體外促進HaCaT和HDF生長并加速體內(nèi)無瘢痕創(chuàng)傷修復(fù)。他們研究發(fā)現(xiàn)TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad4表達(dá)明顯下調(diào)，而TGF-β₃和Smad7表達(dá)明顯上調(diào)。此外，在小鼠皮膚創(chuàng)傷模型中hUC-MSCs源性外泌體可減少體內(nèi)瘢痕形成和肌成纖維細(xì)胞累積。Zhang等報道這些含有特定microRNA的外泌體，例如miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145通過抑制TGF-β₂/Smad2信號通路轉(zhuǎn)化，在抑制肌成纖維細(xì)胞的形成中起關(guān)鍵作用。對于這一點，Jiang等研究表明腫瘤壞死因子誘導(dǎo)基因6(Tumor necrosis factor-inducible gene 6,TSG-6)過表達(dá)的hBM-MSCs源性外泌體可有效改善瘢痕組織病理損傷，減少炎癥因子分泌和小鼠皮膚創(chuàng)傷模型中的體內(nèi)膠原蛋白的沉積，同時抑制瘢痕組織TGFβ₁、p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)Smad2/3磷酸化顯著減少成纖維細(xì)胞。Dalirfardouei等報道人月經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞(Human menstrual MSCs,hMen-MSCs)源性外泌體降低膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ的比例，減少糖尿病小鼠模型中的瘢痕形成，促進體內(nèi)傷口閉合、血管生成和再上皮化。hAT-MSCs源性外泌體也發(fā)揮了相同的作用，通過增加體外N-cadherin、cyclin-1、PCNA 和膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ基因表達(dá)，在體內(nèi)傷口愈合早期階段促進膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的產(chǎn)生，在晚期階段抑制膠原蛋白表達(dá)以減少疤痕形成。此外，人類羊膜上皮細(xì)胞（Human amniotic epithelial cell，hAEC）源性外泌體顯著增強成纖維細(xì)胞體外增殖和遷移能力，通過刺激MMP-1的表達(dá)，在這些細(xì)胞中顯著下調(diào)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ表達(dá)。經(jīng)過對體內(nèi)傷口測定表明，在傷口愈合過程外泌體治療促進膠原纖維的整齊排列。另外，被報道參與傷口愈合過程的其他信號通路是聚ADP核糖聚合酶1（Poly ADP ribose polymerase 1,PARP 1）/凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis-inducing factor,AIF）凋亡通路和Notch信號通路。PARP 1/AIF凋亡通路經(jīng)hUC-MSCs源性外泌體處理后在體外通過抑制AIF核易位和上調(diào)PARP-1抑制HaCaT細(xì)胞凋亡，而在體內(nèi)增強表皮再上皮化和真皮血管生成。體內(nèi)研究表明，人胎兒真皮間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（Human fetal dermalmesenchymal stromal cell,hFD-MSCs）源性外泌體通過激活Notch信號通路在小鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型中可以加速傷口愈合。?

展 望

*注：本文41個文獻(xiàn)，參考文獻(xiàn)此處省略，具體見原文；公眾格式問題，可能會出現(xiàn)上標(biāo)和下標(biāo)格式不規(guī)范，特殊字符無法顯示等情況，望理解。