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癌細胞衍生的細胞外囊泡(EVs)是用于癌癥診斷和預后的有前途的生物標志物。然而，從臨床樣本中難以獲得足夠高的EV產量、缺乏快速和靈敏的分離技術限制了它們的實用性。

來自韓國延世大學的研究人員制造了乳鐵蛋白綴合的2,2-雙（羥甲基）丙酸樹狀聚合物修飾的磁性納米粒子(LF-bis-MPA-MNPs) 的嵌合納米復合材料，用于從人尿液進行簡單而靈敏的EV分離和前列腺癌檢測。該研究發表于J Extracell Vesicles雜志上。?

細胞外囊泡 (EVs)，包括外泌體（直徑 30-150 nm，源自多泡內體的EVs）、微泡（直徑 100-1000 nm，源自質膜出芽的EVs）和凋亡小體（直徑1-4微米，源自凋亡的EV），由大多數類型的細胞釋放。EVs包含DNA、信使RNA(mRNA)、microRNA (miRNA) 和細胞類型特異性蛋白，用作多種疾病（包括癌癥）的生物標志物。體液中的外泌體作為早期疾病檢測的非侵入性生物標志物發揮著特別重要的作用，可以用作無創或微創生物標志物。在體液中，尿液可以大量且頻繁收集，比血清或血漿更簡單和穩定，可用于檢測前列腺癌 (PCa) 等疾病的生物標志物。

miRNA是長度約為18-25個核苷酸的小非編碼RNA，通過削弱mRNA轉錄或促進其降解來下調 mRNA表達。外泌體miRNA，例如miR-21、miR-23a和miR-1246用于結直腸癌(CRC) 以及 miR-21、miR-155、miR-222和miR-29用于肝癌已被報道為臨床診斷的潛在生物標志物。盡管EV可作為腫瘤標志物，但缺陷之一是缺乏快速準確的技術進行EV分離和分析的標準化。目前的分離方法，包括超速離心、基于尺寸的過濾、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀、基于免疫親和性的技術、基于微流控的分離技術受限于耗時、需要純化以在分析前去除雜質或需要笨重且昂貴的設備。此外，通常需要去除污染的蛋白質和RNA，并提出標準來提高基于外泌體的診斷的準確性。因此，應開發更有效的大樣本分離/富集方法并將其應用于基于外泌體的臨床檢測。

納米粒子(NPs)已被廣泛應用。小尺寸、高表面積體積比、磁性和表面涂層后的穩定性使氧化鐵 (Fe3O4) NPs 成為一個簡單方便的分離方法。此外，許多類型的配體（如肽、抗體、葉酸等）可以與磁性納米粒子（MNP）連接。各種具有表面涂層和固定配體的新型Fe3O4 NPs 已被制造用于即時檢測。多種方法可用來合成MNP，例如共沉淀、微乳液、熱分解、溶劑熱法等。在這些方法中，共沉淀法是最廣泛使用和最合適的MNP合成方法，可將顆粒尺寸控制在9 nm左右。?

Fe3O4的缺點之一是由于其在空氣中的氧化活性，這可能導致降解或磁性喪失。聚合物，例如葡聚糖、聚乙二醇（PEG）是用于涂覆MNP的化合物，具有多個官能團（如胺、羧基、硫醇、羥基等）的樹狀聚合物的高度分支化能夠將MNP變的穩定和功能化。樹狀聚合物用于許多應用，例如治療診斷學、生物傳感器、光學、粘合劑和涂層。蛋白質的表面顯示出許多陽離子基團，例如胺、咪唑、胍基。樹狀聚合物和2,2-雙(羥甲基)丙酸 (bis-MPA)樹狀聚合物用于包被NPs，在 MNPs 的表面上進行修飾，MNPs是具有胺末端的樹狀聚合物發散生長的核心分子。表面上更多的官能羥基可以轉化為硫醇官能團，并通過交聯與乳鐵蛋白（LF）的胺基結合。

LF是轉鐵蛋白家族的成員，是一種鐵陽離子結合糖蛋白，分子量為77-80kDa。LF的生物學功能是抗微生物、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲和抗腫瘤活性。使用LF作為納米載體具有許多優點，并且由于其物理特性，可用于EV分離。盡管LF的主要功能是其與游離鐵結合的能力，但其也在生物靶標分離中有應用。LF的 N 端是陽離子和疏水的，在 8.0-8.5 的高pH值下顯示出凈正電荷，因此可以在較寬的pH范圍內保持正電荷。與細胞的質膜類似，EV 帶有凈負表面電荷，主要來自磷脂酰絲氨酸（PS，一種帶負電荷的脂質）可以與LF結合。除了PS，LF還與糖胺聚糖和硫酸軟骨素蛋白聚糖相互作用。LF 與外泌體生物靶點結合另一個原因是 GAPDH的表達，充當了LF 受體。總之，靜電、疏水和生物識別相互作用可能是LF與外泌體結合的關鍵因素。

在這項研究里，研究人員基于靜電相互作用、物理吸收和生物識別相結合開發了LF共軛雙 MPA樹狀聚合物涂層MNPs (LF-bis-MPA-MNPs) 的嵌合納米復合材料，用于EV分離。LF-bis-MPA-MNPs分離EV的速度、效率、回收率和純度優于使用已建立的方法。通過該方法，研究人員成功證明外泌體miRNAs在癌細胞衍生的外泌體顯著高于非癌性外泌體的相對表達。最后，嵌合納米復合材料用于評估來自 20 名前列腺癌患者、10名良性前列腺增生患者和10名健康對照者的尿液樣本中的尿液外泌體miRNA。與健康對照組相比，兩組均顯著上調 miR-21和 miR-346、下調miR-23a 和 miR-122-5p。LF-bis-MPA-MNPs為臨床應用中的人尿液外泌體分析提供了一種快速、簡單和高產率的方法。

參考文獻：Chimeric nanocomposites for the rapidand simple isolation of urinary extracellular vesicles. J Extracell Vesicles.2022 Feb;11(2):e12195.

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