實體瘤的TIL療法：個性化護理標準的途徑

3.1.TIL細胞類型選擇

TIL通常指具有內源性TCR的未修飾T細胞，而CAR-T細胞包含合成的、修飾的TCR。內源性TCR由識別MHC限制性短肽鏈的異二聚體組成，但在沒有募集額外輔助分子的情況下無法啟動下游信號傳導 [24]。相比之下，CAR-T細胞表達來自不受MHC限制并與T細胞信號結構域偶聯的單克隆抗體的合成單鏈受體。第一代CAR由單個CD3ζ TCR激活域組成，而隨后幾代CAR包含一個或多個共刺激分子以進一步增強T細胞信號傳導和激活[25,26,27,28]。因此，CAR-T 細胞可以在與同源新抗原結合后自動激活下游信號通路，而無需外部共刺激分子或共受體的參與。TCR和CAR之間的差異決定了這些T細胞在免疫治療中的功能。TCR的多樣性允許內源性TIL識別更廣泛的未知腫瘤新抗原，而合成單克隆受體的特異性允許高親和力CAR與已知新抗原結合[6,29]。然而，這種與單一新抗原結合的高親和力CAR-T會導致正常細胞上存在繼發于抗原的脫靶毒性的可能性增加[7]。雖然ACT-TIL的毒性主要歸因于淋巴耗竭和IL-2方案，但TIL輸注后繼發罕見的輕微自身免疫（白癜風和葡萄膜炎），而 CAR-T 輸注經常與細胞因子釋放綜合征（CRS）和CAR T細胞相關性腦病綜合征 (CRES) 以及制備方案的毒性[7,30]。因此，CAR-T 優先用于治療具有良好特征突變的血液惡性腫瘤，例如用于B細胞白血病的CD19 CAR-T，而在異質性的ACT中首選更多樣化的腫瘤反應性TIL實體瘤[31]。由于CAR-T的產生受到針對特定新抗原的受體序列知識的限制，因此需要繼續努力識別實體瘤特有的廣泛新抗原以及隨后對同源嵌合受體進行逆向工程，以改善CAR-T細胞的使用和功效。

生成多種腫瘤特異性TIL既復雜又耗時。在從切除的腫瘤中進行初始離體分離和擴增后，針對自體腫瘤細胞系選擇多個 T 細胞克隆以檢測 IFN-γ 活性，作為腫瘤反應性的替代標志物。對腫瘤特異性呈陰性的克隆被消除，而其余的則經歷快速擴增以產生最終輸注產品，該產品通常包含至少 1 × 1010個細胞[32]。從腫瘤切除到細胞給藥的整個過程通常需要 6-8 周 [33]。然而，對TIL-ACT的客觀臨床反應與轉移的 TIL 的平均端粒長度增加相關（CR 為 6.7 kb，PR 為 6.2 kb，無反應 (NR) 為 5.1 kb，p = 0.006），這呈負相關隨著離體培養時間[14,34]。為了減少培養時間，NCI 的外科部門隨后開發了一種 TIL-ACT 方案，其中包含富含 CD8+ T 細胞但未額外選擇腫瘤反應性的“年輕”TIL。接受“年輕”TIL 治療的患者表現出與接受傳統 TIL 治療的患者相似的 ORR。然而，隨著新協議加速并提高了 TIL 生成的成功率，它已被其他機構采用 [13,35,36]。

雖然已經嘗試了其他短期選擇方法，但固有的腫瘤內和腫瘤間異質性使選擇過程復雜化。NCI 最近開發了一種針對自體新抗原的無偏高通量 TIL 篩選，以規避這個問題。在這個新的協議中，TILs 是針對自體抗原呈遞樹突狀細胞 (DC) 脈沖選擇的通過腫瘤全外顯子組測序鑒定的非同義突變衍生的肽庫或串聯小基因[37,38,39]。這種高度敏感的篩選比傳統的自體腫瘤細胞共培養需要更少的時間。此外，當傳統篩查在患者中失敗時，它能夠分離出多個腫瘤特異性 T 細胞克隆，否則將被排除在接受 TIL-ACT 之外 [31,40]。然而，由于全外顯子組測序成本仍然很高，這種選擇方法的廣泛使用目前受到限制。

多項臨床試驗表明，客觀治療反應與輸注 TIL 的總數增加有關，更具體地說，是 CD8+ T 細胞的增加 [14,35,41,42]。從淋巴細胞浸潤低的患者身上分離出的腫瘤通常無法產生足夠數量的再輸注所需的 T 細胞（失敗培養的淋巴細胞浸潤中位數為 8%，成功培養的中位數為 50%，p = 5 × 10-8）[36 ]。相比之下，尚未發現 CD4+ T 細胞數量與治療反應之間存在相關性。整個 CD4+ T 細胞群內的異質性可能導致其在抗腫瘤免疫中的作用不明確。CD4+ T 細胞可分為輔助 T 細胞（TH1、TH2 和 TH17）和 Treg。Treg 分泌抑制持續免疫反應的抗炎細胞因子，它們的存在與不良的臨床預后相關 [43,44]。相比之下，輔助 T 細胞分泌促炎細胞因子和趨化因子，在臨床前模型中增強抗腫瘤反應并介導腫瘤消退 [44,45,46]。病例報告顯示，過繼轉移的腫瘤浸潤性 TH1 和大量 CD4+ T 細胞分別通過腫瘤抗原特異性分泌 IFN-γ 在介導膽管癌和黑色素瘤中的瞬時腫瘤消退中的潛力 [47,48]。然而，過繼轉移富含 CD8+ T細胞的 TIL產品（包含最少的 CD4+ T細胞）導致ORR與大量TIL 相似，這表明 CD4+ T 細胞對觀察到的治療反應沒有顯著貢獻[35,49]。

與客觀治療反應呈正相關的另一個特征是轉移的功能性 TIL 在患者體內的持續存活[10,11,42,50]。在輸注后長達34個月的時間內，已在有反應的患者的外周血中檢測到腫瘤特異性TIL[11]。此外，在一項臨床研究中，增加對治療的反應與增加腫瘤特異性TIL克隆型的半衰期相關（CR 為132-173天，PR為31-53天，NR為13-15天，p

事實上，源自分化程度較低的前體（如中央記憶和幼稚 T 細胞）的效應 CD8+ T 細胞與源自異質大量 TIL 群體的那些相比，表現出增加的效應分子分泌和增殖 [52]。相反，在臨床前模型中，更多分化的 T 細胞的轉移會導致抗腫瘤功效受損并降低總體存活率 [53,54]。對表現出部分反應的轉移性結直腸癌患者的不同 TIL 克隆型的單細胞分析揭示了一組與 T 細胞持久性相關的遺傳特征，類似于分化程度較低的 T 細胞。值得注意的是，與非持久性細胞相比，持久性細胞表達的 EOMES 水平降低（轉錄因子在最終耗盡的 T 細胞中上調），IL7R 水平升高（穩態增殖細胞因子 IL-7 的受體）[55,56,57] .因此，選擇具有更多祖細胞樣表型的 CD8+ T 細胞可能會增加 TIL-ACT 的 ORR。

3.2.細胞因子支持的作用

細胞因子在淋巴細胞的產生、活化和增殖中起著不可或缺的作用。由于對 TIL-ACT 的客觀反應與體內過繼轉移的淋巴細胞的持續存在有關，因此用于 TIL 的離體擴增和輸注后支持的細胞因子成為治療效果的重要決定因素。

IL-2、IL-7、IL-12 和 IL-15 都影響 T 細胞分化，因此是用于治療的 TIL 離體擴增和分化的最佳候選者。IL-2 是一種多效性細胞因子，可誘導細胞類型特異性反應。例如，IL-2 不僅參與 Treg 的分化和穩態，還促進效應 CD8+ T 細胞的分化和增加效應分子的合成 [44,58,59]。自 1980 年代最初的臨床試驗以來，TIL-ACT 方案已將 IL-2 用于體外擴增階段 [9,32]。到目前為止，這已經導致高度可重復且在很大程度上成功地生成了足夠數量的 TIL，用于隨后的過繼轉移。隨著對不同淋巴細胞亞群如何介導腫瘤消退的了解越來越多，目前正在考慮使用其他細胞因子來富集更有效的T細胞。IL-12 是一種潛在的抗腫瘤細胞因子，既可以直接增加T細胞的溶細胞潛能，又可以增加抗原呈遞[60]。鼠模型表明，IL-12介導的幼稚 T 細胞活化產生高度增殖的后代，具有升高的溶細胞功能和增強的抗衰竭能力 [61,62,63]。此外，在多項研究中，IL-2+IL-12引發的T細胞的過繼轉移導致腫瘤消退增強 [61,62,64]。相比之下，IL-7和IL-15 已被確定為維持體內穩態 T 細胞增殖和功能的關鍵因素，尤其是記憶T細胞 [57,65,66]。然而，與IL-2相比，IL-7+IL-15的組合不會導致ACT的效應T細胞在體外產生更好的效果[67]。

除了離體擴增外，TIL方案還使用高劑量(HD) IL-2作為佐劑，以支持轉移后的體內淋巴細胞增殖[32,68]。然而，全身性IL-2治療與嚴重的毒性相關，限制了其廣泛的臨床應用[14,69,70]。事實上，由于嚴重的不良反應，包括但不限于血管滲漏綜合征和神經系統癥狀，大多數患者沒有完成整個轉移后 IL-2治療方案[71]。許多臨床試驗已經探索了減毒或低劑量 (LD) IL-2的使用。這種劑量減少導致更好的治療耐受性和不太嚴重、更短暫的不良事件 [72,73,74,75]。對HD (n = 332)與LD IL-2 (n = 78) 與TIL-ACT療效的薈萃分析顯示，匯總ORR (CRR)估計為43% (14%)和35% （7％），分別[71]。因此，LD IL-2方案有可能引發持久反應，同時最大限度地減少相關的不良反應。然而，在這一點上，涉及LD IL-2的臨床試驗限制了患者入組，沒有試驗直接比較HD與LD IL-2作為TIL-ACT佐劑的療效。

3.3.預處理方案的作用

在 TIL 轉移之前改變宿主免疫環境的必要性早已確立，因為只有添加環磷酰胺才能達到治療效果 [8,12,76]。目前，TIL-ACT 的主要預處理方案包括環磷酰胺 + 氟達拉濱的非清髓性化療 (NMA) 和/或全身照射 (TBI)。這兩種方法都會導致宿主淋巴細胞介導的免疫抑制因子耗盡，這些因子可能會阻礙轉移的 T 細胞的功能 [77,78]。進一步的研究表明，淋巴清除可以消除穩態細胞因子匯，抑制免疫抑制性 Tregs，并增加新抗原的呈遞 [53,79,80]。消除競爭穩態細胞因子 IL-7 和 IL-15 的內源性細胞會導致血清水平升高，這被認為有利于 TIL 的持續存在 [42,69,81]。去除宿主腫瘤浸潤和外周 CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg 可將過繼轉移的 TIL 從外在免疫抑制中解放出來 [43,44,82]。最后，預處理可能會誘導腫瘤細胞經歷免疫原性細胞死亡，從而導致促炎細胞因子和腫瘤新抗原的釋放，從而進一步增強抗腫瘤免疫反應[83]。

淋巴清除強度增加與 TIL-ACT 療效增加之間的關聯進一步證明了準備方案的重要性 [84]。在 NCI 進行的一項臨床試驗中，在預處理 NMA 化療中增加 2 或 12 Gy 照射將 ORR 從 49%（21/43 患者）增加到 52%（13/25 患者）和 72%（18/25 患者），分別在接受 TIL-ACT 治療的轉移性黑色素瘤患者中 [69]。隨后，一項NMA化療與 NMA+ 12 Gy TBI 的隨機試驗顯示完全緩解率相似（兩者均為 24%），但后一組有更多的部分緩解者（22% 對 38%）[42]。雖然患者通常會在淋巴耗竭后 2 至 3 周內恢復內源性骨髓功能，同時外周血液學值恢復到正常范圍，但大多數患者確實經歷了需要高級醫療支持的嚴重治療相關毒性 [69,85,86]。因此，有必要優化預處理方案以最大限度地減少不良事件，以增加 TIL-ACT 的臨床效用。

在TME，各種類型的腫瘤表現出的一種常見的免疫治療耐藥機制是陰性T細胞檢查點通路的上調，例如程序性細胞死亡蛋白1 (PD-1) 和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)。慢性共抑制信號會誘導T細胞衰竭，這是一種由效應器功能和增殖能力喪失定義的功能狀態 [87,88,89]。耗盡的T細胞的積累最終導致腫瘤進展和免疫逃避。如果沒有廣泛的 TME 變化，任何過繼轉移的TIL都將受到相同的外部抑制機制，從而使治療無效。然而，用免疫檢查點抑制劑(ICI)阻斷這些途徑可以重新激活先前耗盡的T細胞，從而促進轉移性腫瘤消退[90]。最近，針對PD-1和CTLA-4的ICI已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于治療多種實體惡性腫瘤[91]。