實體瘤的過繼細胞療法

在過去十年中，免疫療法徹底改變了癌癥治療領域。免疫細胞能夠識別癌細胞的概念始于1900年代初期。然而，直到引入針對檢查點分子的單克隆抗體，如細胞毒性T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）、程序性細胞死亡1（PD-1）及其配體（PD-L1），免疫療法在癌癥中的成功受到限制.過繼細胞療法(ACT)是一種個性化的癌癥免疫療法，涉及施用具有直接抗癌活性的免疫細胞。這種細胞治療性給藥的第一個實驗來自國家癌癥研究所的Rosenberg團隊，通過給藥從切除的腫瘤樣本中獲得并在體外擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。對患有高度免疫原性腫瘤（例如轉移性黑色素瘤）的患者施用TIL顯示出有希望的反應。

基因工程的進步使得在1980年代后期操縱T細胞受體成為可能，并首次嘗試將細胞毒性淋巴細胞重定向到特定的腫瘤抗原。隨著發現T細胞受體(TCR)細胞內亞基CD3ζ足以傳遞細胞的激活信號，隨后嘗試用單鏈變異片段(scFv)改變TCR的細胞外亞基α和β鏈一種免疫球蛋白以形成嵌合抗原受體(CAR)。將共刺激結構域（CD28或4-1BB）引入CAR可提高效力并延遲衰竭，從而改善抗腫瘤作用。另一種選擇是對TCR的α和β 鏈進行基因修飾，以通過主要組織相容性復合物(MHC)呈遞以自然方式識別腫瘤抗原。通過這種方式，T淋巴細胞能夠識別由細胞處理的腫瘤相關抗原，而不僅僅是細胞表面呈現的抗原。

這三種ACT管理方法在過去10年共存，迄今為止在實體瘤中的成功有限。

腫瘤浸潤淋巴細胞

1980年代早期的研究表明，在體外用重組IL2 (r-IL2) 激活的外周淋巴細胞（稱為“淋巴因子激活殺傷細胞”-LAK細胞）輸注能夠在轉移性肉瘤小鼠模型中誘導腫瘤消退。TIL、腫瘤細胞和r-IL2共培養的發展導致開發出一種比 LAK細胞強大50-100倍的產品。對轉移性黑色素瘤患者的研究證實了這種治療是有效的發現，并且還強調了淋巴耗竭化療（環磷酰胺和氟達拉濱）預處理方案對減少調節性T細胞數量和促進歸巢的重要性。TIL生成的進一步改進導致產生可以識別腫瘤細胞的特定TIL的更詳細的協議。通過啟動多個獨立培養物，其中通過細胞因子釋放試驗測試每種培養物的抗原特異性和腫瘤反應性，并在輻照異基因外周血存在下用OKT3（抗CD3）抗體和IL-2擴增反應性培養物單核細胞。擴增培養物在患者輸注前維持約14天。該方法已應用于臨床試驗，在黑色素瘤、非小細胞肺癌和宮頸癌等方面取得了可喜的結果（表 1）。

但是，TIL 的局限性是產品固有的。迄今為止所見的療效似乎僅限于具有高腫瘤突變負擔的“熱”腫瘤。這導致下一波基因工程 T 細胞通過 CART 或 TCR 將淋巴細胞活化重定向到選定的腫瘤抗原。此外，還有一些嘗試通過轉導 CXCR2 趨化因子受體來改善 TIL 向腫瘤的運輸，該受體正在 1 期臨床試驗中進行測試。

基因工程細胞：CART與TCR

目前有多種 FDA 批準的用于血液系統惡性腫瘤的CART細胞療法，這些產品包含一個scFv，它通過細胞內CD3ζ和一個共刺激結構域（CD28或 -1BB）識別CD19。用這些藥物治療后的結果是CD19陽性細胞（包括非腫瘤細胞）完全耗盡，導致B細胞發育不全。需要注意這一點很重要，因為實體瘤的治療將面臨避免非腫瘤細胞對抗血液惡性腫瘤的挑戰。為實體瘤模擬這種策略的嘗試已經很廣泛（表 2），目前正在進行40多項臨床試驗（表 3）。

與TCR相比，這種策略有幾個優點。首先，CART細胞不需要靶抗原的MHC 呈遞，因此不需要組織相容性。這使得產品設計更容易，因為它不需要HLA兼容性 。實體瘤CAR設計的關鍵方面之一是在癌細胞表面識別具有選擇性表達的腫瘤相關抗原，以避免對正常細胞的損傷。用于CART設計的理想腫瘤相關抗原是新抗原。它們是正常組織不產生的高度免疫原性蛋白質。它們由腫瘤細胞中的非同義突變產生或由病毒插入引起的腫瘤中的病毒蛋白引起，例如由Epstein-Barr 病毒(gp350)引起的癌癥。

靶向表面蛋白會出現一些問題。大多數針對實體瘤的 CAR T 研究產生的結果非常差，反應率在 0% 到 25% 之間（表 2）。這種缺乏效力有幾個原因。一是靶蛋白的下調。由于靶蛋白通常對細胞的存活并不重要，因此在一些研究中，在處理后收集組織時會出現快速下調。例如，在一項針對膠質母細胞瘤患者靜脈注射 CAR 抗 EGFRvIII 的臨床試驗中，作者發現在評估輸注后腫瘤的 7 名輸注受試者中，有 5 名 EGFRvIII 的表達水平下降 [18]。另一個問題是販運到腫瘤床。腫瘤微環境具有允許腫瘤生長的免疫抑制條件，并可能阻礙 CAR T 細胞的歸巢。眾所周知，腫瘤會產生低水平的趨化因子，即使它們產生，它也可能與 T 效應細胞中存在的受體不匹配 [19]。

另一個主要障礙是靶抗原在正常細胞中的表達。例如，HER2 的表達在許多實體瘤中很常見，盡管也存在于一些正常細胞中。一名患者因肺上皮細胞中 HER2 的低組成型表達引發呼吸衰竭而死亡，導致一項 HER2（曲妥珠單抗外域）和 41BB.CD28.CD3ζ 信號傳導內域 CAR T 細胞的臨床試驗停止 [20]。為了克服這個問題，開發了具有基于 FRP5 的外域和 CD28.CD3ζ 內域的第二代 HER2-CAR。對肉瘤患者的初步安全性評估表明沒有明顯的毒性，但 T 細胞的持久性有限，并且沒有觀察到抗腫瘤活性 [21]。一種提高 CAR T 細胞持久性的建議策略是 CAR 在病毒特異性 T 細胞中的表達 [22]。這些細胞可以通過其 CAR 提供直接的抗腫瘤活性，但也可以在天然 T 細胞受體 (αβTCR) 與專業抗原呈遞細胞呈遞的潛伏病毒抗原結合后接受適當的共刺激。該策略在 17 名接受病毒特異性 HER2-CAR T 細胞 (FRP5.CD28.CD3ζ) 的 HER2 陽性膠質母細胞瘤患者中進行了測試。一名患者實現了部分反應，并且細胞在外周血中存在長達一年。然而，有限的功效證實了需要改善這些細胞的擴增、功能和持久性[23]。

CAR 的替代策略是使用修改后的 TCR，因為它有幾個潛在的優勢。首先，抗原的種類要多得多，因為任何潛在的細胞內蛋白質都由 MHC 表達。此外，有可能靶向突變的癌癥相關蛋白，從而增加對癌細胞的特異性[24]。還有一些限制，例如將 TCR 的使用限制在某些 HLA 亞型的 MHC 限制。此外，一些針對腫瘤產物（如癌胚抗原 (CEA)）的嘗試未成功，原因是由于抗原在結腸粘膜中的正常表達而導致嚴重結腸炎的“靶向/腫瘤外”毒性 [25]。此外，工程化 TCR 與另一種抗原發生交叉反應的風險也令人擔憂。一項針對 HLA-A*01 限制性 MAGE-A3 肽的 TCR 研究導致嚴重的心臟毒性（兩名患者死亡），原因是識別了收縮肌肉中表達的 Titin 蛋白的表位 [26]。

然而，MAGE-A4 或 NY-ESO 等公共新抗原的使用在最近的臨床試驗中，特別是在滑膜肉瘤中取得了令人興奮的成功結果。在使用表達 NY-ESO-1 c259 的自體 T 細胞的首次人體研究中，一種親和力增強的 TCR 識別 HLA-A2 限制性 NY-ESO-1/LAGE1a 衍生肽，用于轉移性患者滑膜肉瘤在幾個月內顯示出 50% 的患者 (6/12) 得到證實的部分緩解 [27]。使用針對 HLA-A2 限制性 MAGE-A4 的自體 T 細胞進一步顯示了 ACT 在滑膜肉瘤中的價值，其中 7/16 (44%) 的患者使用 ADP-A2M4 實現了部分反應 [28]。如表 4 所示，該策略的抗腫瘤活性導致反應率顯著提高。即使 CAR 以更高的密度表達時，全長 TCR 的敏感性也高于 CAR [7,67]。同時，發現 TCR 可介導較低細胞因子水平的釋放 [74]。因此，與 CAR T 細胞療法相比，TCR 療法的細胞因子釋放綜合征風險可能更低，并且似乎在實體瘤中的 ACT 競賽中處于領先地位。表 5 總結了正在進行的 TCR 治療實體瘤的臨床試驗。

迄今為止，在實體瘤的ACT臨床試驗中看到的活動仍然引發了對該方法的風險/益處的質疑，特別是考慮到使許多患者不符合這些治療條件的耗時程序，以及引起的潛在毒性 通過淋巴清除化療、產品本身或在某些情況下使用的白細胞介素2。出于這個原因，正在研究幾種策略來改善這種治療方式（表 6）。

CART的本地交付

在保持抗腫瘤活性的同時提高耐受性的一種潛在替代方法是局部給藥該產品用于全身擴展有限的腫瘤，例如間皮瘤或中樞神經系統惡性腫瘤。CAR T 細胞的中樞神經系統遞送在 HER2+ 乳腺癌的臨床前小鼠模型中是有效的 [29]。Brown 及其同事報告了一例復發性膠質母細胞瘤患者在將抗 IL13Ralfa2 CAR T 細胞輸注到切除的腫瘤腔和腦室系統后完全緩解的病例。針對惡性胸膜間皮瘤患者的間皮素CAR通過胸膜內給藥產生了25%的客觀緩解率，其中兩名患者通過PET-CT實現了代謝完全緩解。沒有細胞因子釋放綜合征病例突出了該程序的安全性。

另一種有趣的方法是經常觀察到某些實體瘤的寡轉移性擴散，例如在結直腸癌中僅肝臟擴散的情況。在一項 I 期試驗中，抗CEA CAR T肝動脈內經皮輸注在5例CEA陽性結直腸癌轉移瘤中進行了測試，全身毒性百分比低，無嚴重細胞因子釋放綜合征病例，實現了長期穩定一名患者的疾病。

Maus博士小組開發的另一種有趣的方法是對CAR T細胞進行工程改造以分泌雙特異性抗體。他們開發了一種結構來驅動對EGFRvIII特異的CAR和針對EGFR的雙特異性T細胞接合劑的表達。CAR T.BITE的局部給藥完全消除了小鼠膠質母細胞瘤模型中的腫瘤，并且不會對人體皮膚移植物造成毒性。

這些令人鼓舞的結果增加了對該領域的興趣，盡管與地方行政本身相關的困難可能會限制這種方法的影響。

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安全開關

有可能在CAR中包含一個“安全開關”，以在出現不良副作用的情況下關閉活動。該策略已應用于預防半相合干細胞移植中的移植物抗宿主病。如果暴露于更昔洛韋，表達單純皰疹病毒胸苷激酶自殺基因（TK 細胞）的供體淋巴細胞將經歷細胞死亡。

一個類似的策略是將iCasp9安全開關包含在供體T細胞中，用于通過施用生物惰性AP1903化合物激活的半相合干細胞移植。單劑量的化合物能夠在 30 分鐘內消除90%的修飾T細胞。這已經在不同的CAR模型（CD20、CD33、CD19、IL1RAP）中進行了體外和體內測試，迄今為止取得了有希望的非臨床結果。避免引入轉基因的其他建議替代方法是使用代謝開關。通過破壞嘧啶從頭合成途徑中的尿苷一磷酸合成酶，細胞增殖變得依賴于外部尿苷，并且通過調節尿苷供應來控制細胞生長。

另一種選擇是使用阻礙CAR-T活性的藥物。使用達沙替尼作為CAR-T細胞功能的潛在抑制劑源于該化合物能夠阻斷淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(LCK) 的磷酸化，該激酶在受體接合后介導淋巴細胞活化。臨床前研究表明，達沙替尼治療可消除CART和T細胞接合劑雙特異性抗體的細胞因子釋放綜合征。

其他替代方法，如組合靶抗原識別被提議作為降低毒性的潛在手段。使用這種策略，只有在細胞中同時發現兩個靶標（PSMA+/PSCA+；ERBB2+/MUC1+ ；ERBB2+/IL13r+；CD19+/CD133+）時，CAR才會被激活，從而減少消除正常的非腫瘤細胞。然而，由于腫瘤細胞庫“雙陽性”較低，這種選擇性的增加也轉化為活性降低。