上海交通大學、長征醫院公開32名接受自體NK細胞輸注用于抗衰老的臨床試驗數據，證實通過NK細胞輸注讓其向更年輕的方向發展且安全

方法：招募37名中年健康受試者，其中32人靜脈注射擴增的NK細胞，5人靜脈注射生理鹽水。然后，我們通過流式細胞術監測輸注后 4 周內外周衰老和耗竭 T 細胞的變化，以及衰老相關分泌表型 (SASP) 相關因子的血清水平。進行體外共培養測定以研究 NK 介導的針對衰老或耗盡 T 細胞的細胞毒活性。最終表征了 NK 細胞在擴增前后的功能和表型變化。

結果：

基線特征

從 2017 年 7 月到 2018 年 9 月，共有 54 名年齡在 45 到 55 歲之間的受試者中有 47 名被招募到該研究中，因為據報道這些中年人群的 NK 細胞生物學受損 ( 29 , 30). 篩選時排除8名志愿者，其中3名檢測指標不全，2名肝功能檢測有2項以上異常，1名免疫指標異常，1名感染指標陽性，1名血液生化指標異常。因此，本研究招募了 39 名志愿者。他們接受了白細胞去除術和隨后的 NK 細胞給藥。然而，兩名受試者在 NK 細胞給藥后錯過了樣本采集，因此不得不退出研究。最終，有 37 名受試者成功完成了研究，其中男性 18 名，女性 19 名（圖 1）). 重要的是，所有志愿者在參與前都咨詢并簽署了知情同意書。同時，32 名志愿者重新注射了自體 NK 細胞，5 名志愿者注射了生理鹽水。補充表 1中列出了受試者的基線特征和 NK 細胞信息。

自體NK細胞輸注的安全性

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NK細胞給藥后，所有受試者的體溫和血壓均正常。沒有人出現皮疹、局部感染和出血、發燒、發冷、呼吸困難、惡心和嘔吐。然而，一名受試者在細胞輸注后 1 周內出現了難眠癥，此后恢復。一個人在細胞輸注后1周內出現頭暈，這種現象持續了2周才恢復。兩名受試者出現疲勞，其中一名出現輕度疲勞，另一名出現疲勞，均在 2 周內恢復（補充表 2). 此外，我們在細胞輸注后 1 個月進行了常規血液檢查、血液學檢查以及尿液和病毒學檢查。根據ALT、AST、尿素和肌酐的正常血清水平，未觀察到肝毒性和腎毒性。此外，未觀察到異常的 C 反應蛋白 (CRP)、抗甲狀腺球蛋白抗體 (TGAb) 和抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體 (TPOAb) 活性，表明未發生免疫反應和自身免疫效應。此外，1 個月后未觀察到血漿甲胎蛋白 (AFP) 和癌胚抗原 (CEA) 水平升高，有力證實自體 NK 細胞輸注在致瘤性方面是安全的。

NK 細胞輸注后衰老 T 細胞減少

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先前的研究已經證明，衰老細胞的積累會加速與衰老相關的疾病，而 p16 陽性細胞的清除會延緩這種現象 ( 31 )。NK 細胞在清除衰老細胞和抵御癌癥的先天免疫中發揮著重要作用 ( 22 )。因此，進行流式細胞術分析以檢測 CD4 + CD28 -、CD4 + CD57 +、CD4 + KLRG1 +、CD4 + CD28 – CD57 +和 CD4 + CD28 – KLRG1 +的群體作為衰老的 CD4 +基線時以及輸注后 1 周和 4 周時的 T 細胞。結果顯示，在細胞輸注后的兩個時間點，CD4 +和 CD8 + T 細胞群沒有顯著變化（圖 2A、B）。然而，衰老的 CD4 + T 細胞在 NK 細胞輸注后 1 周和 4 周顯著減少（圖 2C）。此外，性別對 NK 細胞輸注引起的衰老 CD4 + T 細胞減少沒有影響（圖 2D）。

正如我們所知，CD8 + T 細胞是主要的腫瘤殺傷細胞群 ( 32 )。CD8 +細胞毒性 T 細胞可以通過表達 FasL 和分泌顆粒酶 B 和 IFN-γ 來減弱腫瘤生長 ( 33 )。然而，衰老 T 細胞的積累會損害 T 細胞介導的反應。因此，我們檢查了基線時以及輸注后 1 周和 4 周時CD28 -、CD57 +、KLRG1 +、CD28 – CD57 +和 CD28 – KLRG1 +衰老 CD8 + T 細胞的百分比。我們發現衰老的 CD8 +在 NK 細胞輸注后 1 周和 4 周，T 細胞顯著減少（圖 2E）。NK 細胞輸注誘導的衰老 CD8 + T 細胞減少與性別無關（圖 2F）。

NK 細胞輸注后耗盡的 T 細胞減少

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在慢性感染和癌癥期間，記憶 T 細胞隨著持續的抗原暴露和炎癥而分化 ( 15 )。據報道，人類在病毒感染（例如 HIV 和丙型肝炎病毒 (HCV)）和癌癥發展過程中會發生 T 細胞耗竭 ( 34 , 35 )。重要的是，耗竭的 T 細胞的特征是 PD-1、TIM-3、CTLA-4 的表達升高以及它們相關信號通路的激活。最近抗 PD-1/PD-L1 抗體在癌癥免疫療法中的成功應用證明了靶向 T 細胞耗竭的治療的重要性和有效性 ( 36 )。然后，我們檢測了 NK 細胞輸注是否影響耗盡的 CD4 +和 CD8的百分比+ T 細胞。結果顯示，CD4 + PD-1 + T 細胞、CD8 + PD-1 + T 細胞、CD4 + TIM-3 + T 細胞和 CD8 + TIM-3 + T 細胞在 NK 細胞輸注后第 1 周顯著減少和 4 周（圖 3A）。這些結果表明，NK 細胞輸注可能通過緩解 T 細胞的衰竭狀態來改善 T 細胞的功能。此外，在 NK 細胞輸注后 1 周和 4 周， PD-1 +和 TIM-3 + T 細胞的減少與性別無關（圖 3B）。

細胞類型影響 NK 細胞輸注誘導的作用

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在接受 NK 細胞的 32 名參與者中，14 名志愿者重新注射了從冷凍保存的 PBMC 中擴增的 NK 細胞，18 名志愿者重新注射了從新鮮 PBMC 中產生的 NK 細胞。我們想探討 NK 細胞輸注誘導的免疫系統改變是否取決于 NK 細胞的起始狀態。我們通過單因素方差分析對這兩組進行多重比較分析。結果顯示，在新鮮 NK 細胞輸注組中， TIM3 +、KLRG1 +、CD28 – CD57 +和 CD28 – KLRG1 + T 細胞在 1 周或 4 周時顯著減少（圖 4A），而 CD28 -、 CD57 +, PD-1 + T 細胞與冷凍 NK 細胞輸注相比，新鮮 NK 細胞輸注組沒有顯著變化（圖 4B）。

NK 細胞輸注后關鍵 SASP 相關因素減少

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衰老細胞隨著衰老而積累并導致 SASP 相關因子的釋放，包括促炎細胞因子（IL-1α、IL-17 和 IL-6）、趨化因子（IL-8）和蛋白酶（MMP-1、MMP -1α 和 MMP-1β）。這些 SASP 相關因子在與衰老相關的炎癥、疾病和發病率中起著關鍵作用 ( 37 – 39 )。因此，為了檢查 NK 細胞輸注是否降低了 SASP 相關因子的系統水平，我們測量了 NK 細胞輸注前后收集的血漿中的細胞因子水平。我們發現 NK 細胞輸注后血漿中關鍵 SASP 相關因子的水平較低，包括 IL-6、IL-8、IL-1α、IL-17、MIP-1α、MIP-1β 和 MMP1，而 IFN- γ 是一種非 SASP 相關因子，并未持續顯著改變（圖 5). 這些結果表明，NK 細胞輸注可以減弱 SASP 相關因子的積累并提高 CD4 +和 CD8 + T 細胞的活性。

衰老T細胞和衰竭T細胞在對照組無明顯變化

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我們已經知道，在輸注 NK 細胞后，衰老 T 細胞和衰竭 T 細胞的百分比顯著下降。為了進一步驗證 NK 細胞輸注與 T 細胞減少之間的關系，我們獲得了五名注射生理鹽水的志愿者（補充表 1）。我們發現注射鹽水后總 CD4 +和 CD8 + T 細胞百分比沒有顯著變化（圖 6A）。PD-1+ 和 TIM3+ T 細胞等耗盡的 T 細胞百分比在注射生理鹽水后沒有減少，衰老的 T 細胞群如 CD28 – 、CD57 + 、KLRG1 +?、 CD28 – CD57 +也沒有減少和 CD28 – KLRG1 + T 細胞（圖 6B、C）。最后，我們探索了更大隊列中的數據，以評估這五名受試者實現衰老 T 細胞減少的能力（補充表 3）；以排除生理鹽水也會引起衰老細胞變化的假說。

PostNK 細胞殺死衰老的 CD4?+?T 細胞但不殺死正常的 CD4?+?T 細胞

最后，我們想知道 NK 細胞輸注如何影響衰老 T 細胞的百分比。先前的研究表明，NK 細胞可以殺死和清除衰老細胞以避免旁分泌作用。因此，我們首先在體外與自體postNK細胞共培養PBMC（補充圖2 ），并檢測CD28 -和CD28 + CD4 + T細胞的百分比。我們發現 CD4 + T 細胞的百分比在 postNK 細胞附著后增加。在導致 CD28 + CD4 + T 細胞略微增加的同時，postNK 細胞附著顯著導致死亡 CD28 – CD4 +比例增加T 細胞（圖 7A–C ），對死亡 CD4 + T 細胞的增加至關重要。此外，我們在非放射性細胞毒性測定 (Pro-mega) 中使用 CD28 – CD57 + CD4 +或 CD28 + CD4 + T 細胞與自體 postNK 細胞（補充圖 2 ）共培養，而不是總 PBMC。結果表明，postNK 細胞附加以劑量依賴性方式特異性殺死 CD28 – CD57 + CD4 + T 細胞而非 CD28 + CD4 + T 細胞（圖 7D）。當CD3 + PD1+ T 細胞與 preNK 或 postNK 共培養，E:T 細胞比例為 10:1，孵育 20 小時后未檢測到 LDH 活性（數據未顯示）。此外，NK 細胞加入對衰竭 T 細胞上的 PD1 表達幾乎沒有影響（圖 7E、F）。postNK 細胞顯示出對 K562 和穿孔素分泌的顯著改善的細胞毒性（圖 7G、H）。然而，通過 ELISA，僅在供體 1 的前 NK 細胞與 K562 的共培養樣品中檢測到 IFNγ，平均濃度為 412.5 pg/ml。

preNK 和 postNK 細胞的表型特征

為了更好地理解為什么輸注擴增的 NK 細胞顯示出 T 衰老和衰竭的顯著改善，我們進一步比較了體外擴增程序后 NK 細胞的表型變異（圖 8A-C）。兩個個體的 preNK 細胞主要表達 NKG2C、KLRG1 和 CD57，同時具有低得多的 NKG2A 水平。LAG3 在 preNK 和 postNK 細胞中幾乎不表達。擴增程序后，postNK 細胞的 NKG2C、CD57 和 KLRG1 表達較低，但 NKG2A 和 TIM3 表達較高。此外，不同個體的 postNK 細胞顯示出比其 preNK 對應物更相似的指示受體表達模式。

結論：

總之，本研究最初揭示了 NK 細胞輸注對中年健康個體 T 細胞功能障礙和細胞衰老的影響。我們的研究結果表明，自體 NK 細胞給藥是顯著緩解 T 細胞衰老和衰竭以及 SASP 關鍵成分的有效方法。postNK 細胞表現出更高的細胞毒活性，可以特異性地直接識別和清除衰老的 T 細胞。此外，在體外觀察到激活和抑制受體（包括 NKG2C、NKG2A、KLRG1、LAG3、CD57 和 TIM3）的不同表達模式擴展過程，可能有助于它們的功能改變。我們的數據重要地表明，至少對于免疫系統而言，衰老可以通過自體 NK 細胞的轉移向更年輕的方向操縱。進一步探索應關注自體NK細胞影響T細胞衰老和衰竭的分子機制。此外，進一步研究這些衰老和衰竭的 T 細胞群、它們的起源以及它們在免疫病理條件下的功能將極大地促進 NK 免疫療法的臨床應用。