根據文獻、issues and challenges>和前幾天分享的自動化設備文章（點擊鏈接跳轉）等來討論各個步驟可以選擇的滿足產業化、自動化和封閉要求的設備有如下這些：

1、單采血

? ???外周血單個核細胞（PBMC）即外周血中具有
單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。T細胞
主要從捐獻者或者患者收集外周血中分離獲得，分離方法主要為密度梯度離心法。常用設備有以下幾種，利弊和優缺點如表所示：

具體設備依次如圖所示：

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2、白細胞的標準和分離工藝

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3、T細胞分選（富集）

? 一些組使用CliniMACS系統富集或消耗特定細胞亞群，其中相應的抗體與順磁珠連接。Fred Hutchinson癌癥研究中心和西雅圖兒童醫院為CD4+（T輔助細胞）和CD8+（細胞毒性T細胞）富集WBCs，以便輸入具有確定的CD8+ / CD4+細胞比例的產品。目前可采用磁珠分選的方法在MiltenyiCliniMACs Plus或Prodigy設備上進行T、B、NK、單核等細胞的富集，以及DynaMag? CTS?系統可對CD3+T細胞進行分選。

4、T細胞活化

? 超順磁性抗CD3/CD28抗體包被的磁珠（例如DynalDynabeads;Human-ativator）用于制造許多CART細胞產品（包括CTL019，現在已獲得FDA的Kymriah（Novartis的CART產品）。根據質量控制要求進行經過驗證的測定，以確保在輸注之前從產品中有效去除DynalDynabeads。我們使用一種簡單的，經過驗證的形態學測定法，對每3×106個細胞

? 在UCL，我們擁有MACSGMPTransAct（MiltenyiBioTec）的經驗，該聚合物是一種可生物降解的可聚合納米基質，并浸有抗CD3/CD28 mAb，從而消除了去除磁珠的要求。

? 目前臨床上，激活T細胞的主要方法是用抗CD3/CD28抗體包被的順磁珠激活。抗CD3/CD28 mAb和IL-2也占了1/3，其中包括了KITE Pharma的KTE-019（現在批準為Yescarta）。使用磁珠方法的大量研究與Novartis（現已批準為Kymriah）和Juno Therapeutics產品相關。

5、基因傳遞/轉導

逆轉錄病毒和慢病毒載體是CAR T細胞生產中最常用的基因傳遞方法，約占41％和在所有制成品中分別占54％。轉導效率通常很高，需要T細胞激活才能進行基因轉移。

使用“睡美人”（SB）或PiggyBac轉座子/轉座酶技術進行非病毒基因遞送比病毒載體便宜得多。由于基因整合的隨機性存在插入誘變的風險，但據認為效率比病毒載體要低。缺點包括基因轉移效率低和需要延長體外培養以產生臨床上相關的細胞數量。SB CAR T細胞的試驗正在進行中。

6、T細胞擴增和全自動CAR T細胞制造平臺

基因轉移后，T細胞擴增，達到功能上封閉的培養系統中臨床應用所需的細胞數量，可以使用多種方法，包括T瓶，平板或培養袋以及生物反應器，例如G-Rex燒瓶（Wilson WolfManufacturing），WAVE生物反應器（GE Life Systems）和CliniMACSProdigy（MiltenyiBioTec）。最近的評論表明，有43％的CAR T 細胞臨床試驗使用搖擺生物反應器，而使用靜態培養袋的為35％，使用T瓶的為22％。

T型燒瓶不適合大規模工作，因為它們勞動強度大，并且需要在安全柜中進行多個開放式處理步驟。

靜態培養袋可以通過無菌管焊接在一起，并提供半封閉培養系統，但是培養基交換是手動過程，不易擴展。生物反應器具有幾個優點：G-Rex燒瓶是具有優化的氣體交換和采樣選項的封閉系統圓柱形容器，可在培養箱中快速擴增細胞。

GEWAVE 搖擺生物反應器是一種自動化的封閉培養系統，包括放置在搖擺平臺上的透氣性培養袋（Cellbag；GEHealthcare Life Sciences）。內置的質量流量，pH，氣壓和CO2和O2濃度傳感器允許自動灌注和氣體交換從而減少了體力勞動和介質消耗。使用RM生物反應器系統代替靜態培養袋擴大TILs可將勞動強度降低至33％，培養基消耗降至50％。WAVE的問題包括缺乏可擴展性（每個生物反應器只能生產一種產品），成本和潛在的生物學影響，例如，據報道其偏向CD4+ T細胞擴增。

為了真正實現自體CART細胞生產的可擴展性，非常需要符合GMP要求的標準化自動化全封閉系統。美天旎的CliniMACSProdigy是目前使用最廣泛的自動化細胞制造平臺。Prodigy允許根據可編程活動矩陣在一次性管道套件（TS520）上進行T細胞的選擇，激活，轉導，擴增，取樣和收獲，并提供與表型和功能相似的CART細胞。

7、洗滌和成制劑步驟

比較成熟的方法主要是離心換液和半透膜，目前也有其他新技術的發明。該步驟的目的是將培養基換成凍存液，對細胞進行洗滌，該工序要確保細胞狀態盡量不受到傷害，回收率需達到要求。

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8、T細胞冷凍保存

從質量的角度來看，此步驟至關重要，因為冷凍保存欠佳會導致細胞數量減少，生存能力受損以及細胞表型和功能改變。

一些小組在-80℃的機械冷凍機中被動冷凍CAR T細胞產品。CAR T細胞的低溫保存越來越多地在可編程的速率控制冷凍機（CRF）中進行，該冷凍機每分鐘降低1℃的溫度以避免形成細胞內冰晶。一旦充分脫水，細胞即可迅速冷卻至最終儲存溫度，并轉移至氣相液氮（LN）中，以在低于-150℃的溫度下儲存。從質量的角度來看，CRF的優點包括凍結的一致性，編程的多功能性和單個產品的數據可追溯性。缺點包括與運行設備所需的大量液氮相關的高成本。新型機械CRF（例如漸近線）的運行成本較低，并且可以克服與在封閉空間中使用LN有關的一些安全問題。

輸液前，應從氣相LN中提取冷凍保存的產品，并根據合同規定的優良作坊（GDP）原則，將其運輸到合同規定的快遞公司經溫度記錄，經過驗證的LN干托運人的醫院。

9、自動化設備助力CAR-T生產

同時cocoon也在開發類似產品，如圖所示：

還有其他機械化設施可供選擇：

各自利弊分析，如下表所示：

最后根據文獻來看看諾華、Juno、Kite三巨頭的生產工藝有所區別，選用的生產系統也相應差異。他們用的工藝和設備如下：