CAR-NK！競爭激烈卻無人沖線的火熱賽道

在過去的幾年里，細(xì)胞免疫療法已經(jīng)成為某些類型血液系統(tǒng)惡性腫瘤的一種新的治療選擇。伴隨著多款CAR-T療法步入臨床，自體細(xì)胞產(chǎn)品的局限性和CAR-T細(xì)胞毒性的挑戰(zhàn)也隨之凸顯。人們迫切的需要更方便、安全和有效的新型細(xì)胞治療產(chǎn)品。

自然殺傷(NK)細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的一部分，具有獨(dú)特的優(yōu)勢，包括成為“現(xiàn)貨”療法的潛力。而首次在復(fù)發(fā)/難治性淋巴惡性腫瘤患者中進(jìn)行CD19 CAR-NK輸注的人體試驗(yàn)證明了這一療法的安全性，以及具有良好的臨床活性。

基于這些令人鼓舞的臨床反應(yīng)，研究人員正在積極探索通過延長體內(nèi)持久性和克服功能衰竭機(jī)制，進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-NK細(xì)胞效力的方法。除了這些調(diào)節(jié)CAR-NK細(xì)胞內(nèi)在特性的策略外，還有研究人員致力于將在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的成功轉(zhuǎn)化到實(shí)體瘤領(lǐng)域。

　　新視野——將CAR-NK免疫療法轉(zhuǎn)化至臨床

2018年，中國大陸的一組研究人員首次報(bào)道了CAR工程N(yùn)K細(xì)胞的臨床應(yīng)用。使用第三代CD33導(dǎo)向CAR結(jié)構(gòu)來轉(zhuǎn)導(dǎo)NK-92系衍生的NK細(xì)胞，研究人員在1期研究 (NCT02944162)中安全輸注劑量高達(dá)5×109的CAR-NK細(xì)胞進(jìn)入三名AML患者體內(nèi)。雖然該療法被證明是安全的，并且沒有任何明顯不良事件的證據(jù)，但沒有患者并未獲得持久的緩解。受到輻射的NK-92細(xì)胞在體內(nèi)的持久性有限，在輸注后1周內(nèi)CAR-NK水平下降到檢測閾值以下。

事實(shí)上，CAR工程淋巴細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增和長期持久性構(gòu)成了細(xì)胞治療的關(guān)鍵。相較于單抗療法，通過促進(jìn)持久的臨床反應(yīng)，CAR工程淋巴細(xì)胞將具有決定性的優(yōu)勢。然而NK細(xì)胞的生理壽命僅有2周，任何一個(gè)CAR-NK工程化療法都需要克服這一生理桎梏，才能實(shí)現(xiàn)持續(xù)的反應(yīng)。

　　CAR-NK免疫療法——無人駛?cè)氲乃{(lán)海

CAR-NK療法的研究目前處于起步階段，臨床研究的數(shù)量逐年增加。此外，在研究的靶標(biāo)方面，CD19抗原在血液腫瘤中最常見。在實(shí)體瘤中進(jìn)展最為廣泛的CAR-NK療法包括腫瘤相關(guān)抗原HER2、MUC1和PMSA等靶點(diǎn)。

目前，一些正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在調(diào)查CAR-NK細(xì)胞治療血液學(xué)腫瘤和實(shí)體瘤的安全性和有效性

　　

　　▲ 圖片來源：參考資料2

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在2020年時(shí)CAR-NK領(lǐng)域交易額就已高達(dá)到47億美元，其中國外累計(jì)發(fā)生了6筆交易，金額高達(dá)35.33億美元。國內(nèi)恒潤達(dá)生完成了2億元B+輪融資，據(jù)了解這筆資金將會(huì)花在CAR-T細(xì)胞臨床批件和針對(duì)實(shí)體瘤新靶點(diǎn)的CAR-T、TCR-T、CAR-NK等管線[3]。

　　

　　▲ 圖片來源：參考資料3

而在過去的幾年。CAR-NK免疫療法的早期臨床試驗(yàn)活動(dòng)正在空前加速，目前有多種CAR修飾的NK細(xì)胞產(chǎn)品正在臨床研究中。在整個(gè)試驗(yàn)領(lǐng)域，研究人員正在使用不同來源的NK細(xì)胞和各種模塊化CAR設(shè)計(jì)，對(duì)多種目標(biāo)抗原進(jìn)行CAR構(gòu)建。總體而言，呈現(xiàn)兩個(gè)主要趨勢。最明顯的是，靶向疾病的范圍發(fā)生了變化。雖然大多數(shù)早期的試驗(yàn)都集中在針對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但最近的許多試驗(yàn)試圖探索CAR-NK細(xì)胞免疫療法作為對(duì)抗實(shí)體瘤的新手段。其次，人們越來越重視通過多重基因編輯方法實(shí)現(xiàn)的更復(fù)雜的構(gòu)建體設(shè)計(jì)，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的效力和持久性。

　　

　　

　　▲當(dāng)前評(píng)估CAR-NK免疫療法的1/2期試驗(yàn)概述(圖片來源：參考資料1)

癌細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的免疫抑制機(jī)制，以阻止淋巴細(xì)胞浸潤的影響，逃避腫瘤的免疫監(jiān)視。雖然早期的研究主要集中在癌癥內(nèi)在的免疫逃逸機(jī)制，但隨著研究的深入，研究人員逐步認(rèn)識(shí)到，免疫細(xì)胞特異性因子是基本表型重組的基礎(chǔ)，它們使免疫細(xì)胞處于功能失調(diào)狀態(tài)，無法有效控制腫瘤。

尋找一種方法使CAR工程N(yùn)K細(xì)胞更有效，同時(shí)不影響其良好的安全性，這對(duì)于下一代細(xì)胞療法至關(guān)重要。當(dāng)前的CAR-NK治療限制圍繞三個(gè)反復(fù)出現(xiàn)的主題：CAR-NK療法只成功地應(yīng)用于范圍極為狹窄的癌癥特異性抗原。其次，有限的體內(nèi)持久性和最終的免疫細(xì)胞衰竭是長期療效的一大障礙。最后，向腫瘤床的運(yùn)輸受損，以及操縱惡性腫瘤微環(huán)境的能力減弱，阻礙了NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的有效相互作用，最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃避。

　　擴(kuò)大CAR-NK在血癌中的治療范圍

基于CAR-NK細(xì)胞的免疫療法的大部分初始工作都集中在一組非常有限的靶抗原上，主要是在血液癌領(lǐng)域。而尋找合適的腫瘤抗原來解決B淋巴惡性腫瘤以外的其他癌癥，并擴(kuò)大CAR-NK細(xì)胞免疫療法的治療范圍，也是CAR-NK療法迫切需要突破的挑戰(zhàn)之一。

　　侵襲性T細(xì)胞惡性腫瘤

侵襲性T細(xì)胞惡性腫瘤代表了一個(gè)高度未滿足的醫(yī)療需求領(lǐng)域，臨床結(jié)果令人沮喪，目前的治療選擇非常有限。事實(shí)證明，基于CAR-T的治療方法具有內(nèi)在的挑戰(zhàn)性，因?yàn)镃AR-T細(xì)胞和轉(zhuǎn)化T淋巴母細(xì)胞之間共同表達(dá)會(huì)帶來自相殘殺的風(fēng)險(xiǎn)，這種現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致注入的CAR-T細(xì)胞攻擊自身，從而導(dǎo)致治療失敗。另一個(gè)令人擔(dān)憂的原因是自體T細(xì)胞產(chǎn)品在制造過程中可能被惡性T細(xì)胞污染。CAR-NK細(xì)胞缺乏T細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)還具備“現(xiàn)貨“療法潛力，為治療T細(xì)胞惡性腫瘤提供了引人注目的優(yōu)勢。

如何減輕T細(xì)胞定向CAR修飾的免疫細(xì)胞固有的長期T細(xì)胞再生障礙的不利影響?其中一種策略是使用雙特異性接合劑，恢復(fù)非工程N(yùn)K細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力，該接合劑可特異性地將NK細(xì)胞導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞并通過其CD16A受體的高親和力結(jié)合介導(dǎo)NK活化。

有研究表明，臍帶血衍生的NK細(xì)胞用細(xì)胞因子IL-12、IL-15和IL-18進(jìn)行預(yù)處理，使用四價(jià)雙特異性CD16A:CD30免疫細(xì)胞接合劑AMF13首次成功應(yīng)用預(yù)復(fù)合NK細(xì)胞誘導(dǎo)針對(duì)CD30陽性惡性腫瘤的CAR樣反應(yīng)。采用這種方法，研究人員在體外證明載有AFM13的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力增加。在攜帶淋巴瘤的小鼠中進(jìn)行測試時(shí)，AFM13復(fù)合NK細(xì)胞引起了顯著改善的抗腫瘤反應(yīng)并顯著延長了生存期，而沒有觀察到明顯的不良毒性。這種方法目前正在臨床中進(jìn)行測試(NCT04101331)。

　　急性髓性白血病

針對(duì)AML的工程CAR構(gòu)建已被證明具有挑戰(zhàn)性，有兩個(gè)重大障礙。白血病母細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的共同抗原表達(dá)，如CD123和CD33情況，這增加了靶向脫瘤毒性的潛在威脅，將引起長期多譜系血細(xì)胞減少。

不同AML人群中的克隆異質(zhì)性和不同的抗原表達(dá)代表了另一個(gè)挑戰(zhàn)，這使單抗原靶向的治療方法不能完全抑制疾病，從而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，這一挑戰(zhàn)在存在不同的白血病起始克隆的情況下尤為顯著。與大量白血病細(xì)胞相比，白血病起始克隆具有不一致的抗原特征。

而針對(duì)CD4(CD28-4-1BB-CD3ζ)的第三代CAR構(gòu)建體在細(xì)胞系衍生的異種移植小鼠模型中被證明可特異性消除原發(fā)性CD4陽性AML原始細(xì)胞并抑制疾病進(jìn)展。使用新型定點(diǎn)基因插入CRISPaint技術(shù)(CRISPR輔助插入標(biāo)記)來設(shè)計(jì)兩個(gè)第三代CD33導(dǎo)向CAR-NK候選物(CD4-4-1BB-CD3ζ和NKG2D-2B4-CD3ζ)的創(chuàng)新方法已經(jīng)據(jù)報(bào)道在體外引起抗白血病活性。

Senti Bio的首席科學(xué)官Gary Lee博士的研究小組報(bào)告了一種巧妙的策略來生成邏輯門控CAR-NK電路以解決兩個(gè)長期存在的挑戰(zhàn)，即異質(zhì)和共享抗原表達(dá)，這些挑戰(zhàn)迄今為止阻礙了AML細(xì)胞療法的成功。在預(yù)測最佳抗原組合的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的生物信息學(xué)方法的指導(dǎo)下，他們設(shè)計(jì)了邏輯門控CD33-OR-FLT3-NOT-EMCN CAR-NK細(xì)胞。當(dāng)與FLT3+EMCN-AML原始細(xì)胞和健康的FLT3+EMCN+造血祖細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，他們的研究同種異體CAR-NK候選物表現(xiàn)出對(duì)靶向原始細(xì)胞的選擇性和差異性殺傷，同時(shí)保留了造血干細(xì)胞區(qū)室。

　　多發(fā)性骨髓瘤

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)許多NK激活配體，因此應(yīng)具有獨(dú)特的定位，以利用CAR修飾的NK細(xì)胞的力量進(jìn)行靶向治療。CAR-NK免疫療法對(duì)抗多發(fā)性骨髓瘤的報(bào)道可以追溯到2014年，其中一組報(bào)告了CD138導(dǎo)向CAR構(gòu)建體用于基因修飾NK-92MI細(xì)胞的體外療效。另一組賦予NK-92細(xì)胞以CS1為靶點(diǎn)的CAR受體，延長了異種移植小鼠模型的體內(nèi)存活時(shí)間。

然而，由于NK細(xì)胞具有共同的CS1和CD38表達(dá)，因此研究人員擔(dān)心NK細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致自相殘殺，因此早期利用NK細(xì)胞靶向漿細(xì)胞疾病的研究受到了限制。獨(dú)立于NK細(xì)胞的內(nèi)在約束，該領(lǐng)域已經(jīng)將其注意力轉(zhuǎn)移到探索新的抗原，包括BCMA，這些抗原有可能在先前接觸過抗CD38藥物的患者中誘導(dǎo)緩解。

　　尋求更強(qiáng)抗癌效力,哪里會(huì)是下一個(gè)突破口

過繼細(xì)胞免疫療法已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用到臨床，預(yù)示著血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的一個(gè)新的、有希望的時(shí)代。目前已有多款CD19靶向的CAR-T療法獲批，而隨著FDA批準(zhǔn)靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤，過繼細(xì)胞療法的治療范圍已經(jīng)成功擴(kuò)展到CD19陽性淋巴樣惡性腫瘤之外。

雖然CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品為難治性和復(fù)發(fā)性血液惡性腫瘤患者帶來了新希望，但自第一款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品獲得市場批準(zhǔn)以來，近5年的實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)也為該領(lǐng)域的研究人員帶來了一些提醒：除了與自體細(xì)胞制造相關(guān)的繁瑣物流和細(xì)胞治療相關(guān)毒性的高發(fā)生率外，最緊迫的問題仍然是長期疾病控制不理想。正如最初關(guān)鍵性試驗(yàn)的最新結(jié)果所顯示的那樣，當(dāng)前一代CAR-T產(chǎn)品仍然無法為許多患者提供長期療效，有相當(dāng)一部分接受治療的患者最終復(fù)發(fā)并死于疾病。

近年來，CAR工程化的NK細(xì)胞獲得了相當(dāng)大的關(guān)注。因?yàn)镹K細(xì)胞的獨(dú)特的生物學(xué)特性使它們對(duì)癌癥免疫治療極具吸引力。NK細(xì)胞是先天免疫細(xì)胞，通過多種作用機(jī)制介導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

傳統(tǒng)的理論認(rèn)為，NK對(duì)異常細(xì)胞的識(shí)別主要是由MHC-I表面表達(dá)的缺失驅(qū)動(dòng)，隨著時(shí)間的推移，人們對(duì)激活受體和抑制受體的多種刺激的復(fù)雜整合有了更微妙的理解，這些刺激共同決定NK細(xì)胞激活狀態(tài)和目標(biāo)參與。

　　下一個(gè)技術(shù)前沿——多重基因編輯

　　合理的構(gòu)造設(shè)計(jì)

除了將CAR-NK細(xì)胞重定向到不同的靶抗原外，最近的研究重點(diǎn)已越來越多地轉(zhuǎn)向基于不同跨膜和細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域的模塊化組合的優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以增強(qiáng)CAR-NK效力。

借助當(dāng)今可用的多功能基因工程能力，研究人員正著手對(duì)CAR結(jié)構(gòu)進(jìn)行微調(diào)，以誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤反應(yīng)，增加抗原親和力或延長體內(nèi)持久性。目前，研究人員已經(jīng)探索到多種共刺激元件可產(chǎn)生更有效的抗腫瘤反應(yīng)，包括來自免疫球蛋白超家族(CD28、ICOS)、TNF受體超家族(4-1BB、CD27、OX40和CD40)的結(jié)構(gòu)域和其他包括CD40L和toll樣受體(TLR)。

早期的CAR-NK構(gòu)建體更多的是基于參與T細(xì)胞激活的共刺激域，現(xiàn)在人們越來越重視NK特異性信號(hào)轉(zhuǎn)接器，其中DAP10、DAP12和2B4發(fā)揮著特別重要的作用。這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)接器在與它們各自的上游受體結(jié)合后介導(dǎo)NK細(xì)胞活化。

在一項(xiàng)針對(duì)CD19靶向CAR-NK候選藥物的臨床前研究中，與單獨(dú)使用CD3ζ信號(hào)的構(gòu)建物相比，加入DAP10(NK激活受體NKG2D的生理適配器)增強(qiáng)了抗腫瘤的效力。類似的觀察結(jié)果已經(jīng)被其他研究人員報(bào)道，他們通過在前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)靶向CAR構(gòu)建的中加入DAP12，以及間皮質(zhì)靶向的iPSC衍生的NK細(xì)胞中使用2b4增強(qiáng)信號(hào)策略。

　　武裝CAR

前三代CAR對(duì)CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的修改依賴于生理上存在的免疫細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域。被稱為“武裝CAR”的第四代結(jié)構(gòu)采用了截然不同的方法，通過結(jié)合分子有效載荷，從而賦予CAR修飾的免疫細(xì)胞具有前所未有的額外特性和功能。這種方法使CAR構(gòu)建體能夠被設(shè)計(jì)來解決細(xì)胞免疫療法的一些固有生物學(xué)限制，從而將CAR工程定位于合成生物學(xué)革命的中心。

　　

　　▲ CAR 構(gòu)造設(shè)計(jì)的演變(圖片來源：參考資料1)

可以說，最緊迫的生物約束是在缺乏外源細(xì)胞因子支持的情況下，CAR-NK的體內(nèi)持久性受到限制。雖然細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用是可行的，但它也有相當(dāng)大的安全性問題，并可能在無意中刺激免疫抑制的免疫細(xì)胞。

利用現(xiàn)代雙順反子和多順反子載體平臺(tái)，第四代結(jié)構(gòu)可以包含不止一種理想的基因修飾，這種工程方法被稱為多重基因工程。

　　CAR-NK免疫檢查點(diǎn)的基因破壞

盡管采用過繼性NK細(xì)胞療法取得了顯著成功，但免疫細(xì)胞耗竭仍然是尚未解決的挑戰(zhàn)。為了突破這一挑戰(zhàn)，研究人員需要思考如何提高長期的體內(nèi)抗腫瘤功效。為了構(gòu)建下一代CAR-NK療法，基礎(chǔ)NK細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究再次成為關(guān)注的中心，研究人員在識(shí)別NK細(xì)胞免疫功能的負(fù)調(diào)節(jié)因子方面進(jìn)行了大量的工作。

使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯為調(diào)節(jié)潛在的免疫細(xì)胞生物學(xué)開辟了全新的途徑。特別是多重基因工程策略允許以定點(diǎn)方式進(jìn)一步改進(jìn)CAR修飾的免疫細(xì)胞，從而破壞對(duì)免疫細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)面影響的分子途徑。因此已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)開始了設(shè)計(jì)下一代CAR-NK免疫療法的征程，這些療法具有增強(qiáng)的效力、增加體內(nèi)持久性和對(duì)功能衰竭機(jī)制的抵抗力，這些研究足以顛覆細(xì)胞療法領(lǐng)域。

　　

　　▲ 構(gòu)建下一代 CAR-NK 免疫療法的多重基因工程策略(圖片來源：參考資料1)

通過破壞CAR-NK功能的負(fù)調(diào)節(jié)以增強(qiáng)抗腫瘤控制，抑制免疫檢查點(diǎn)的基因靶向破壞已經(jīng)成為一個(gè)誘人的概念。NK細(xì)胞的激活狀態(tài)受到激活和抑制表面受體的復(fù)雜相互作用所控制，而檢查點(diǎn)阻斷旨在使這種平衡向增強(qiáng)抗腫瘤免疫傾斜。

NKG2A是最突出的種系編碼的抑制性NK細(xì)胞受體之一，其基因缺失與表達(dá)其同源配體HLA-E的腫瘤的細(xì)胞毒性潛力增加有關(guān)。TIGIT是另一個(gè)維持平衡免疫反應(yīng)所必需的抑制檢查點(diǎn)，阻斷TIGIT也同樣被證明可以防止NK細(xì)胞耗竭。

　　抵御免疫抑制的腫瘤微環(huán)境

除了NK細(xì)胞的內(nèi)在免疫檢查點(diǎn)外，還有一些由惡性腫瘤微環(huán)境引起的外在因素共同為免疫細(xì)胞的浸潤創(chuàng)造了非常不利的環(huán)境。營養(yǎng)缺乏、酸度和缺氧等因素，混合剝奪了浸潤效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性。此外，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出吸引調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的機(jī)制，例如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，以及骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)、血小板、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌免疫抑制細(xì)胞因子(如轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ)，腺苷，吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)和前列腺素E2(PGE2))，這進(jìn)一步消除了殘余的有效抗腫瘤反應(yīng)。

腺苷是這些細(xì)胞外免疫抑制代謝物之一，通過阻斷NK細(xì)胞表面A2A腺苷受體(A2AR)的表達(dá)，一個(gè)研究小組在BRAF突變黑色素瘤的異種移植小鼠模型中使用A2AR缺陷型NK細(xì)胞，觀察到了增強(qiáng)的腫瘤控制效果。

此外，還有研究團(tuán)隊(duì)通過使用CRISPR/Cas9編輯對(duì)TGFBR2基因進(jìn)行靶向干擾，成功地使原代人類NK細(xì)胞對(duì)免疫抑制性轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ)具有抗性。在這些觀察的基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)還證明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSC)移植的小鼠模型中，使用小分子抑制劑和基因消融對(duì)TGFβ受體信號(hào)傳導(dǎo)的破壞，可以保留NK細(xì)胞功能，并阻止GSC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞抑制表型的形成。

這些研究共同強(qiáng)調(diào)了如何使用新的基因工程方法，使CAR修飾的免疫細(xì)胞對(duì)一些最臭名昭著的免疫抑制機(jī)制產(chǎn)生抵抗力，以解除惡性腫瘤微環(huán)境的干擾，這一研究方向?qū)⒗^續(xù)在人類癌癥治療中產(chǎn)生重要影響，尤其是針對(duì)實(shí)體瘤時(shí)。

　　提高CAR-NK細(xì)胞活性

　　調(diào)節(jié)CAR-NK代謝

目前，針對(duì)免疫代謝途徑已成為一個(gè)有趣的概念，以使NK細(xì)胞更具代謝活力并保持其功能能力。在NK細(xì)胞中，IFN-γ的產(chǎn)生依賴于葡萄糖驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化。一旦激活，NK細(xì)胞就會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性的代謝變化，從而增加糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)的速率，以支持產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需的能量。

雷帕霉素復(fù)合物1(mTORC1)在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞代謝中起著關(guān)鍵作用，研究表明，CISH信號(hào)的破壞產(chǎn)生對(duì)CAR-NK細(xì)胞的代謝重組，從而保持升高的mTORC1和MYC活性，促進(jìn)體內(nèi)持久性和增強(qiáng)抗腫瘤活性。

在轉(zhuǎn)錄水平上，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和MYC已被確定為協(xié)調(diào)代謝適應(yīng)的兩個(gè)中央調(diào)節(jié)元件，使活化的NK細(xì)胞能夠有效地啟動(dòng)免疫應(yīng)答。MYC信號(hào)通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的表達(dá)以及增加有絲分裂，使代謝機(jī)制適應(yīng)NK細(xì)胞的特定需求。NK細(xì)胞中維持細(xì)胞內(nèi)MYC蛋白水平的一種機(jī)制是通過糖原合成酶激酶3(GSK3)介導(dǎo)的磷酸化以及隨后的泛素化和蛋白酶體降解，研究發(fā)現(xiàn)，GSK3的抑制可穩(wěn)定NK細(xì)胞中的MYC水平，從而提高其抗腫瘤效力。

　　誘導(dǎo)NK細(xì)胞記憶樣表型形成

NK細(xì)胞歷來被認(rèn)為是先天免疫系統(tǒng)。然而，隨著細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣表型的發(fā)現(xiàn)，最近的研究對(duì)這一范式提出了越來越多的挑戰(zhàn)。

因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣表型，Todd A. Fehninger和他的團(tuán)隊(duì)將這種方法應(yīng)用于臨床，并證明用IL-12、IL-15和 IL-18對(duì)分離的NK細(xì)胞進(jìn)行預(yù)激活可強(qiáng)烈誘導(dǎo)形成記憶樣NK細(xì)胞表型，同時(shí)還具有增強(qiáng)的針對(duì)髓系的效應(yīng)子功能白血病細(xì)胞。基于他們的觀察，一項(xiàng)評(píng)估白介素預(yù)激活NK細(xì)胞概念的1期臨床試驗(yàn)(NCT01898793)中招募了AML患者，并觀察了56%可評(píng)估患者的臨床反應(yīng)，其中有四名患者(44%)獲得了完全緩解。

除此之外，還有研究小組報(bào)道了CD19-CAR修飾的記憶樣NK細(xì)胞成功應(yīng)用于異種移植淋巴瘤小鼠模型。目前，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)現(xiàn)在正在調(diào)查和分析支撐這種獨(dú)特的記憶樣NK表型的免疫代謝特征。隨著越來越多的證據(jù)表明線粒體功能障礙與NK細(xì)胞免疫反應(yīng)受損有關(guān)，線粒體健康尤其成為關(guān)注的焦點(diǎn)，促進(jìn)線粒體健康以改善NK細(xì)胞功能的策略已在研。

　　即將到來的細(xì)胞治療新時(shí)代

NK細(xì)胞，即使經(jīng)過基因工程改造以表達(dá)CAR分子，仍保留其通過其天然受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞的固有能力，從而為它們提供了額外的、獨(dú)立于CAR重定向殺傷的抗腫瘤反應(yīng)。值得注意的是，NK 細(xì)胞不依賴于T細(xì)胞受體 (TCR) 進(jìn)行細(xì)胞毒性殺傷。與T細(xì)胞競爭者相比，這賦予了他們更有利的安全性，在同種異體條件下，T細(xì)胞競爭者需要進(jìn)一步進(jìn)行基因改造以規(guī)避移植物抗宿主病 (GvHD)。

此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產(chǎn)生啟動(dòng)CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過單鏈抗體識(shí)別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識(shí)別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體(NKp46、NKp44和NKp30)、NKG2D和DNAM-1(CD226)。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血(PB)、臍帶血(UCB)、人類胚胎干細(xì)胞(HESC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生，而NK 細(xì)胞的每種來源都有其獨(dú)特的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。

　　CAR-NK療法在實(shí)體瘤中的挑戰(zhàn)嘗試

　　CAR-NK療法的多抗原嘗試

盡管細(xì)胞免疫療法開辟了治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有希望的途徑，但這些成果迄今尚未成功轉(zhuǎn)移到實(shí)體瘤的治療中。除了 CAR-NK 免疫療法的內(nèi)在挑戰(zhàn)(例如有限的體內(nèi)持久性和功能衰竭)之外，實(shí)體瘤對(duì)基于細(xì)胞的治療策略構(gòu)成了一系列獨(dú)特的挑戰(zhàn)，包括其復(fù)雜的克隆異質(zhì)性、與健康組織共享的抗原表達(dá)以及固有的敵對(duì)免疫抑制微環(huán)境。此外，實(shí)體瘤已經(jīng)進(jìn)化出下調(diào)其表面能夠活化NK細(xì)胞配體的機(jī)制，以達(dá)到免疫逃避，并且可以有效地削弱免疫細(xì)胞向腫瘤床的運(yùn)輸。

盡管存在這些挑戰(zhàn)，但在針對(duì)多種抗原，如：HER2(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;NCT03383978)、PSMA(前列腺癌;NCT03692663)、間皮素(卵巢癌;NCT03692637)、MUC1(晚期實(shí)體瘤;NCT02839954)、NKG2D(晚期實(shí)體瘤;NCT03415100)和 ROBO1(晚期實(shí)體瘤;NCT03940820 和胰腺癌;NCT03941457)的多項(xiàng)目前正在進(jìn)行的早期研究中，人們越來越關(guān)注使用細(xì)胞療法對(duì)抗實(shí)體瘤。

　　基因工程改善CAR-NK歸巢效應(yīng)

為了實(shí)現(xiàn)有臨床意義的抗腫瘤反應(yīng)，并使工程細(xì)胞療法廣泛用于治療實(shí)體瘤，設(shè)計(jì)下一代CAR-NK療法時(shí)，需要增強(qiáng)向腫瘤床的遷移以及提高穿透實(shí)體腫瘤屏障的能力。幾個(gè)研究小組目前正在研究NK趨化因子受體的基因修飾，以使NK細(xì)胞更有效地歸巢到腫瘤部位。

在腎細(xì)胞癌中，經(jīng)過修飾以表達(dá)超生理水平 CXCR2 的NK細(xì)胞表現(xiàn)出向疾病表現(xiàn)部位的運(yùn)輸改善。類似地，在EGFRvIII誘導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞上強(qiáng)制表達(dá)趨化因子受體4 (CXCR4)可以提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型的存活率]。已有研究團(tuán)隊(duì)在靶向NKG2D配體的CAR中檢測了CXCR1的異位表達(dá)，并在小鼠腹膜卵巢癌模型中證實(shí)了免疫細(xì)胞浸潤的改善和抗腫瘤功效的增強(qiáng)。

許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤本質(zhì)上是單克隆或寡克隆疾病，而實(shí)體腫瘤的特征是具有高度異質(zhì)性的復(fù)雜克隆形態(tài)。單一抗原定向細(xì)胞療法在對(duì)抗由多個(gè)共進(jìn)化克隆驅(qū)動(dòng)的異質(zhì)腫瘤時(shí)面臨重大障礙，每個(gè)克隆都有其獨(dú)特的免疫表型和抗原表達(dá)模式。用于對(duì)抗實(shí)體腫瘤的細(xì)胞基礎(chǔ)治療還必須解開腫瘤和健康組織之間共享抗原表達(dá)的復(fù)雜性，以避免無意中誤傷和非腫瘤毒性。

雙或多特異性靶向則成為了新的突破點(diǎn)，這可以減輕實(shí)體瘤異質(zhì)性和共享抗原表達(dá)帶來的挑戰(zhàn)。在設(shè)計(jì)治療高難治性疾病(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的研究中，NK-92衍生的NK細(xì)胞配備了對(duì)野生型EGFR和EGFRvIII均具有特異性的雙特異性CAR構(gòu)建體。當(dāng)注射到兩種不同的GBM異種移植模型中時(shí)，雙靶向 CAR-NK 細(xì)胞有效地抑制了腫瘤的生長并提高了生存率，而不依賴于EGRF突變狀態(tài) 。

2021 年初，Jeffrey Miller 的小組介紹了他們在多特異性現(xiàn)成B7-H3靶向 iPSC來源的CAR-NK細(xì)胞的部分成果，該細(xì)胞可以識(shí)別多種實(shí)體瘤。B7-H3 (CD276) 是 B7 蛋白超家族的成員，在多種腫瘤中上調(diào)，特別是在轉(zhuǎn)移性環(huán)境中，并且與預(yù)后不良有關(guān) 。除此之外，該研究團(tuán)隊(duì)還在體外檢測到針對(duì)卵巢癌、前列腺癌、骨癌和乳腺癌細(xì)胞株的強(qiáng)細(xì)胞毒性信號(hào)。這對(duì)作為泛癌抗原具有顯著的吸引力。

　　CAR-NK療法在血癌和實(shí)體瘤中雙開花

　　CAR-NK細(xì)胞療法治療實(shí)體瘤

　　1、國內(nèi)首個(gè)”現(xiàn)貨型”CAR-NK臨床試驗(yàn)獲藥監(jiān)局批準(zhǔn)

2021年11月11日，國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心通過了一款我國自主研發(fā)的針對(duì)“晚期上皮性卵巢癌治療的靶向間皮素(Mesothelin，MSLN)嵌合抗原受體NK細(xì)胞(CAR-NK)注射液”(簡稱：CAR-NK注射液)的臨床試驗(yàn)申請。

　　

據(jù)悉，此款產(chǎn)品是國內(nèi)首例“現(xiàn)貨型”異體來源的CAR-NK產(chǎn)品。這也標(biāo)志著我國的免疫細(xì)胞藥物治療實(shí)體瘤的研究邁入了新的里程碑!

　　2、1年生存率翻一倍,CAR-NK療法在實(shí)體瘤中療效暴增

Clinical Cancer Research雜志曾發(fā)布一項(xiàng)關(guān)于肺癌的2期臨床試驗(yàn)報(bào)告。熱休克蛋白70(Hsp70)在70%左右的中晚期肺癌中高表達(dá)，NK細(xì)胞在體外先用Hsp70激活，相當(dāng)于在體外先讓NK細(xì)胞與未來的敵人先遭遇、先“結(jié)仇”，然后回輸給病人，讓NK細(xì)胞在體內(nèi)正式與癌細(xì)胞殊死搏斗——這樣一種在體外先用抗原肽刺激、賦予NK細(xì)胞一定特異性的作法，是近年來研究的熱點(diǎn)。

　　

這項(xiàng)臨床試驗(yàn)一共入組了16例III期非小細(xì)胞肺癌患者，一組接受傳統(tǒng)的放化療綜合治療，一組接受放化療聯(lián)合Hsp70預(yù)激的NK細(xì)胞回輸治療。

結(jié)果顯示：Hsp70預(yù)激的NK細(xì)胞回輸治療，配合傳統(tǒng)的放化療，可以將1年的生存率從33%翻倍到67%，初步結(jié)果振奮人心。

　　CAR-NK細(xì)胞療法治療血液腫瘤

　　1、有效率73%!CD19 CAR-NK對(duì)白血病和淋巴瘤效果顯著

根據(jù)MD安德森癌癥中心I / IIa期試驗(yàn)的結(jié)果，以CD19為靶點(diǎn)的臍帶血來源的CAR-NK細(xì)胞療法，在大多數(shù)復(fù)發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的患者中顯現(xiàn)出臨床療效，而且未觀察到重大毒性反應(yīng)。該試驗(yàn)結(jié)果近日發(fā)表在New England Journal of Medicine上。在參與該研究的11名患者中，有8名(73%)對(duì)治療有反應(yīng)，其中7名達(dá)到了完全緩解!5名有反應(yīng)的患者繼續(xù)接受緩解后治療。沒有患者出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性。這意味著他們在中位隨訪13.8個(gè)月時(shí)無疾病跡象。

這是一種新型的療法，首先需要從臍帶血庫中存儲(chǔ)的臍帶血中分離出NK細(xì)胞，并對(duì)它們進(jìn)行基因工程改造，引入可識(shí)別癌細(xì)胞表面靶標(biāo)的CAR。這些CAR NK細(xì)胞回輸給患者。

　　2、再添利器!iPSC來源的CAR-NK療法針對(duì)淋巴瘤效果頗佳

2021年12月13日，在2021年美國血液學(xué)會(huì)(ASH)年會(huì)上，國外研發(fā)公司Fate Therapeutics展示了針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤(BCL)患者的FT596項(xiàng)目1期研究的積極中期數(shù)據(jù)。

ASH上的摘要展示了截至2021年10月11日的臨床數(shù)據(jù)，包含了來自第一、第二和第三單劑量隊(duì)列(分別為3000萬、9000萬和3億細(xì)胞)的25名可評(píng)估患者(單藥組n=12;聯(lián)合組n=13)，其中24名患者對(duì)療效具有可評(píng)估性(單藥組n=12;聯(lián)合組n=12)。這25名患者接受了四種先前治療線的中位值和兩種先前含有CD20靶向治療的中位值。

在這25例患者中，15例患者(60%)患有侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，15例患者(60%)對(duì)既往治療無效，8例患者(32%)先前接受過自體CD19 CAR-T細(xì)胞治療。在ASH展示的數(shù)據(jù)截止日期之后，聯(lián)合組第三單劑量隊(duì)列中增加了一名患者對(duì)初始抗腫瘤反應(yīng)具有可評(píng)估性，第四單劑量隊(duì)列(9億細(xì)胞)中有7名患者(單藥組n=1;聯(lián)合組n=6)對(duì)于安全性和初始抗腫瘤反應(yīng)具有可評(píng)估性。

　　CAR-NK免疫療法的時(shí)代即將到來

盡管最近取得了進(jìn)展，但關(guān)于臨床施用 CAR-NK 細(xì)胞免疫療法的基本問題仍然存在。這些包括最佳的患者選擇，以及在其他已建立的治療方案(包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的自體和同種異體干細(xì)胞移植)的背景下對(duì) CAR-NK 免疫療法進(jìn)行理想的治療順序。而如何通過識(shí)別預(yù)后生物標(biāo)志物，以及評(píng)估CAR-NK治療的最佳排序，才能更好地為高危患者提供CAR-NK免疫治療，是未來研究的重中之重。

雖然此前報(bào)告的首次成功地將基于 CAR-NK 的細(xì)胞療法應(yīng)用于高危淋巴惡性腫瘤的臨床應(yīng)用代表了癌癥免疫療法領(lǐng)域的一個(gè)重要里程碑 ，但它僅標(biāo)志著未來幾年細(xì)胞工程創(chuàng)新浪潮的開始。在可預(yù)見的未來，以自體和異體干細(xì)胞移植為形式的傳統(tǒng)非抗原特異性細(xì)胞治療，將繼續(xù)在高危惡性血液病患者的管理中發(fā)揮重要作用。然而隨著時(shí)間的推移，基于抗原特異性的CAR療法很可能會(huì)發(fā)展到更先進(jìn)的地步。

基于 CAR-NK 細(xì)胞的同種異體“現(xiàn)貨”療法，由于其在同種異體環(huán)境中的廣泛適用性和與自體細(xì)胞產(chǎn)品相比的巨大成本效益，尤其有望取代長期存在的治療模式。對(duì)于實(shí)體瘤，目前正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的第一份中期報(bào)告?zhèn)涫芷诖@將為人們對(duì)細(xì)胞免疫療法如何快速征服這一高度未滿足的醫(yī)療需求領(lǐng)域提供更強(qiáng)有力的論證。

更令人鼓舞的是，近年來研究活動(dòng)得到了推動(dòng)，許多有前途的 CAR-NK 細(xì)胞候選產(chǎn)品正在利用高度創(chuàng)新的下一代基因工程方法來應(yīng)對(duì)實(shí)體瘤的獨(dú)特挑戰(zhàn)，并有望在短期內(nèi)推進(jìn)臨床試驗(yàn)。支撐這些發(fā)展的基礎(chǔ)是在越來越強(qiáng)大的多組學(xué)和高維單細(xì)胞分析的推動(dòng)下，人們對(duì)基礎(chǔ)免疫細(xì)胞生物學(xué)的不斷增長的理解，這在許多方面為一系列創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。隨著基因工程能力的強(qiáng)大進(jìn)步，這些見解有望推動(dòng)進(jìn)一步的治療創(chuàng)新，并隨著時(shí)間的推移從根本上改變長期存在的治療模式，顯著改善臨床結(jié)果，造福未來幾代患者。

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