新一代的無病毒CAR-T細胞治療

過繼轉移嵌合抗原受體（CAR）T細胞是一項強有力的技術，它徹底改變了免疫治療的方式。其在難治性和復發性血液系統惡性腫瘤中完全和長期的療效令人印象深刻，這也為實體腫瘤的治療開辟了新的可能性。然而，細胞治療的廣泛應用受到了T細胞轉染常用病毒載體自身局限的阻礙。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精準基因編輯的時代，新的無病毒T細胞工程化方法正在成為下一代CAR-T細胞制造的更通用、靈活和可持續的替代方法。

迄今為止，臨床試驗中批準或研究的大多數CAR-T細胞治療都是利用病毒載體，特別是逆轉錄病毒和慢病毒載體。病毒載體是具有高效基因轉移和長期應用歷史的標準化系統，已經證明了在過繼性T細胞治療的安全性。

然而，病毒載體轉導長基因的能力受到衣殼的限制。病毒衣殼直徑大約為100nm，通常不能容納超過8-9 kb的基因。然而，隨著CAR-T技術的更新迭代，需要轉入額外的激活原件或者不同特異性的CAR，實現更高的藥效、安全性和適用性。

此外，臨床應用的病毒生產通常需要兩到三周的時間，在GMP條件下和生物安全2級（BSL2）設施中進行，需要經過熟練培訓的員工。這種高成本、復雜性以及個性化治療的需要最終影響了CAR-T產品的價格，可能達到每人數十萬美元，使普通的患者望而生畏。

最后，病毒載體具有固有的免疫原性風險，這是由對載體編碼表位的體液和細胞免疫反應引起的，這可能限制轉導細胞的效力和持久性。

諾貝爾獎獲得者遺傳學家芭芭拉·麥克林托克Barbara McClintock在20世紀40年代研究玉米籽粒顏色變異時，最初發現了基因組中存在移動序列。玉米中的這些“跳躍基因”當時被稱為轉座因子（TE）或轉座子。

TE分為兩類，逆轉錄轉座子和DNA轉座子。逆轉錄轉座子使用RNA中間體通過復制粘貼機制移動，代表人類基因組中最常見的轉座子類。DNA轉座子通過DNA中間體移動，并用于基因轉移應用。大多數DNA轉座子家族都有一個編碼轉座酶基因的元件，其兩側是反向末端重復序列（ITR）。轉座酶識別并結合整合到ITRs中的元件，催化將轉座因子從其原始位置切除，并將其整合到基因組中的另一個位置。目前，廣泛使用的轉座子系統，包括Sleeping Beauty（SB）和piggyBac（PB）。非病毒轉座子載體具有多功能性、低免疫原性和易于生產的特性。然而，它們通常比病毒的轉染效率低。

mRNA的非病毒傳遞通常通過電穿孔或納米顆粒實現。一旦進入細胞且不需要到達細胞核，mRNA被翻譯成編碼的蛋白質，并且通常在2-4次細胞分裂后丟失，這種方法避免了整合載體相關的遺傳毒性風險，使該策略成為CAR-T細胞中一個安全的良好方法。

在長時間的進化“睡眠”后醒來，魚類基因組中發現的SB，成為第一個在脊椎動物細胞中顯示活性的轉座子，從而為基因治療開辟了新的視野。基于經典的Tc1/mariner DNA II類TE，這些“跳躍”單元能夠通過剪切粘貼機制從一個基因組位置轉移到另一個基因組位置。SB載體由兩個功能組分組成：轉座子DNA，它攜帶有ITR側翼的感興趣基因，以及SB轉座酶，它識別ITR序列，并將轉基因從供體DNA動員到基因組內的受體位點。

與病毒系統相比，這種策略的一大優勢是更大的裝載能力。插入物的大小與轉座機制的效率呈負相關。最佳裝載大小不高于6kb。但其升級版本包括兩個完整的轉座子單元，可以將負載增加到11kb，從而擴充了基于SB載體的克隆能力。此外，當與細菌人工染色體（BACs）結合時，SB在人類胚胎干細胞中可以傳遞高達100 kb的轉基因。

在臨床應用方面，Cooper等人的團隊首次將SB工程化抗CD19 CAR-T細胞應用于臨床試驗，兩項臨床試驗（NCT00968760、NCT01497184）證實了SB工程化抗CD19 CAR-T細胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自體或異基因造血干細胞移植（HSCT）后作為輔助治療的安全性。

此外，目前還有正在美國和歐洲使用SB平臺進行的CAR-T研究。UltraCAR-T平臺基于非病毒系統通過SB載體傳遞多個基因，利用該平臺，正在CD33 CAR和mbIL15（PRGN-3006）的自體細胞，用于治療r/r急性髓系白血病和高危骨髓增生異常綜合征（MDS）。目前，PRGN-3006正在一項劑量遞增/擴展研究（NCT03927261）中，評估在r/r急性髓系白血病核高危MDS成年患者中的安全性。初步數據表明，PRGN-3006輸注具有良好的耐受性，在接受淋巴濾過治療的患者中獲得50%的緩解率，與CAR-T細胞擴增和持續性相關。

與SB載體一樣，PB系統由PB轉座酶（PBase）構成，其形式為mRNA或DNA，以及攜帶所需基因的單獨轉染質粒。PB轉座子載體的設計以單個開放閱讀框（ORF）為特征，其兩側是ITR，PB中的ITR具有特征性的不對稱性。轉座酶識別轉座子兩側的ITR，并通過剪切粘貼機制將轉基因整合到基因組DNA中。PB在哺乳動物細胞中具有比SB更高的轉座子動員轉座活性，比病毒載體具有更大的裝載能力（高達14 kb），并允許通過設計多順反子盒進行多個轉基因傳遞。

目前，越來越多的臨床前數據支持基于PB的CAR-T制造平臺的可行性和安全性，這使得該系統能夠進入臨床試驗。在澳大利亞開展的CARTELL試驗是一項I期臨床研究（ACTRN12617001579381），旨在研究通過PB轉座子系統獲得的供體衍生抗CD19 CAR-T細胞的療效和安全性。早期結果表明，其活性類似于用高應答率病毒載體生成的抗CD19 CAR-T細胞。另外，分別在日本（UMIN000030984）和中國（NCT04289220）進行的兩項I期研究正在調查使用PB系統制造的抗CD19 CAR-T細胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前為止，沒有一名患者顯示出劑量限制性毒性。一名患者表現出持續9個月的B細胞再生障礙。

雖然轉座子工程化的CAR-T細胞在臨床試驗中都處于初始階段，但一些已經表現出一定的臨床療效?？笲CMA CAR-T細胞（P-BCMA-101）通過PB平臺設計，為了改善轉座，其在研究過程中改變了制造工藝，包括使用納米質粒，以減少骨架尺寸并使ITR更接近。細胞產物顯示出高組成的記憶干T細胞（TSCM）。90名R/R MM患者接受了P-BCMA-101治療，早期結果顯示，初始劑量遞增的總有效率（ORR）為57%，與利妥昔單抗聯合使用的ORR為73%，毒性很低（NCT03288493）。

30多年前，Malone的開創性研究表明，與脂質混合的RNA可以被人類細胞吸收并從中翻譯蛋白質。從那時起，RNA就被用于基因工程的多個方面，例如恢復突變基因的功能表達，敲除基因以沉默表達，修改細胞表型或編碼抗原。RNA成功表達蛋白質取決于其穩定性和翻譯效率。這些特征由順式作用元件決定，例如5’帽結構、polyA尾、編碼序列的組成以及可能存在于分子5’和3’端的非編碼區域。

RNA適合多種細胞轉染方法，包括電穿孔、陽離子脂質和陽離子聚合物。已經有許多體外和體內臨床前研究，通過mRNA將CAR引入T細胞，用于在血液腫瘤和實體瘤的模型系統中進行測試。雖然基于mRNA的治療被證明可以減少靶向效應、降低毒性并緩解整合相關的安全性問題，但蛋白質表達的瞬時性在這些應用中也是一個缺點。

淋巴細胞遺傳修飾的另一種方法是以DNA的形式將感興趣的轉基因與編碼轉座酶的RNA一起轉染。當與編碼目的基因的DNA載體一起共轉導到靶細胞時，以mRNA形式編碼轉座酶有幾個優點。首先，轉座酶表達的瞬時性降低了轉座子重新切除和重新整合引起的二次轉座事件的發生率；其次，這種方法可以精確滴定SB mRNA和CAR DNA的比率，以實現持久整合。

從mRNA瞬時表達CAR的潛在安全優勢可能在血液學和實體瘤環境中提供較低的毒性。已有臨床研究對以CD123和CD19為靶點的血液系統惡性腫瘤以及以間皮素和c-Met為靶點的實體腫瘤進行測試。雖然已有的研究報告顯示基于mRNA的CAR-T細胞是安全的，通常沒有嚴重的不良事件，但一個共同點是需要重復給藥3-6個高劑量。需要多次輸注高劑量的mRNA CAR-T細胞很可能與缺乏轉基因細胞持久性有關，旨在延長這些患者體內活動的持續時間，但重復給藥可能會導致其他并發癥。

納米載體

為了應對未來的挑戰，除了轉座子平臺外，基因工程的另一個非病毒工具是納米載體，納米載體的使用正在成為一種可能的解決方案，以克服目前基因傳遞中的障礙，例如毒性和低轉染效率。

在納米技術的最新進展中，作為最前沿的發現之一，Bozza等人開發了一種非整合DNA納米載體，能夠生成在體外和體內都具有活性的CAR-T細胞。該平臺不含病毒成分，能夠在分裂細胞的細胞核中進行額外的染色體復制，在不需整合的情況下維持持續的轉基因表達。此外，它還具有非病毒載體的所有優點：非免疫原性、簡單、多功能且生產成本低廉。

新型生物材料

另一方面，通過使用開發的新型生物材料來改善CAR-T細胞的分離、激活和基因修飾，正在取得進展。一個例子是使用合成DNA適配體和互補逆轉技術，允許從PBMC中分離出高純度和高產量的無標記CD8+T細胞。這種方法的最大優點是可以通過具有不同特異性的適配體在單個分離步驟中分離多個不同的T細胞群。

基因編輯

基因編輯和靶向敲除分別依賴于宿主DNA雙鏈斷裂（DSB）修復和同源定向修復（HDR）過程，HDR通常在原代細胞中發生頻率較低，并且僅限于小的轉基因，導致轉染效率較低。為了更高效地提供DNA插入，CRISPR/Cas9最近與轉座子結合，以提高RNA引導整合的效率，使用轉座酶催化整合。為此，有研究小組進行了將CRISPR/Cas9與SB轉座子結合的實驗，結果表明，它們適用于未來的非病毒臨床應用。識別和降低基因組重排和易位風險的方法可以允許在免疫治療中進一步開發基因編輯的潛在臨床應用。

迄今為止，成功的CAR-T細胞治療都與用病毒載體工程化的T細胞有關。然而，復發、制造過程的復雜性以及這些技術在包括實體瘤在內的其他疾病中的應用，需要更復雜的設計和基因轉移技術來適應這些挑戰。為了填補這些空白，非病毒技術正在不斷取得進展，可以肯定的是，未來很快就會看到它們在CAR-T細胞治療方面的更多應用。

參考文獻：

1.The Past, Present, and Future of Non-Viral
CAR T Cells. Front Immunol.2022; 13: 867013.