提高CAR-T細胞的持久性

在過去十年中，我們在提高CAR-T細胞療法的療效方面取得了顯著進展。然而，其臨床益處仍然有限，尤其是在實體腫瘤中。即使在血液腫瘤中，由于多種因素，包括T細胞擴增不良和過繼轉移后缺乏長期持續性，對CAR-T療法有反應的患者仍有復發的風險。這一問題在實體瘤中更為明顯，因為腫瘤微環境對T細胞的存活、浸潤和活性有負面影響。事實上，癌癥的標志之一就是TME中過多的抑制性決定因素導致T細胞功能受損，從而導致T細胞耗竭。

有限的持久性仍然是CAR-T療法發展的一個重大障礙，這是從細胞制造步驟開始就遇到的問題。包括CAR的設計和體外操作以及培養條件，可能在其中發揮關鍵作用。因此，工程化CAR-T細胞以提高其存活率并逆轉或防止耗竭表型可能是一種合乎邏輯的治療方法。現代合成生物學和基因組編輯技術提供了機會，迄今為止，一些研究已經采取了一些限制和創造抗耗竭T細胞的方法，并在幾個關鍵的臨床試驗中進行了測試。這些方法可能改善CAR-T細胞的持久性問題，為患者帶來希望。

CAR的設計

細胞外CAR結構域的類型、連接單鏈抗體與跨膜結構域的間隔區類型以及構成CAR的共刺激結構域已被證明對T細胞功能和持久性有深遠影響。

臨床試驗中使用的大多數CAR來源于小鼠，這可能導致體液和CD8+T細胞介導的免疫反應，導致免疫排斥。將含有小鼠成分的CAR-T細胞重新輸入到首次治療后出現CD19+復發的患者中基本上是無效的。此外，細胞表面的小鼠CAR受體簇可產生強直信號，導致T細胞耗竭。2016年，帶有人源化scFv的CAR-T進入臨床試驗，人源化CAR顯示出與小鼠CAR相似的細胞毒性活性，但是由于較低的免疫原性而增強了持久性。

CAR的親和力影響強直信號，對靶細胞過強的親和力可能導致T細胞耗竭。一項研究開發了一種CAT-CAR（CD19單鏈抗體），其與CD19的親和力比從傳統的CAR低40倍。該結構在復發或難治性兒童BLL患者中進行了測試，臨床研究發現，14例CAR-T細胞擴增增加的患者中有11例表現出持續性。

此外，共刺激域在CAR-T細胞的持久性和有效性中也起著關鍵作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L。幾項研究發現，配備4-1BB結構域而非CD28結構域的CAR結構中的T細胞持久性增強。其他研究報告，含有4-1BB的CAR-T細胞顯示出增強的記憶T細胞（T_EM）表型，這可能延遲CAR-T細胞耗竭。ICOS屬于CD28共刺激分子家族，研究證明，CAR結構中ICOS和4-1BB共刺激結構域的組合顯著增加T細胞的持久性。

盡管存在相互矛盾的證據，但人們認識到CD28-CAR與高效應器功能和有限的T細胞持久性相關，而4-1BB-CAR和ICOS-CAR的效力較低，但持續時間較長。因此，這些觀察結果表明，共刺激域的結構是影響CAR-T細胞持久性的重要因素。

體外操作和淋巴清除

制造T細胞的過程需要從患者身上獲取足夠數量的健康T細胞。然而，經過化療治療，尤其是那些含有氯法拉濱或阿霉素的化療，導致淋巴細胞減少會使最終的CAR-T細胞質量不理想，用于輸注的T細胞類型嚴重影響治療的效果。

事實上，通過使CD4/CD8比率正?；蚴褂糜字苫蛴洃浖毎麃喨?，在臨床前模型中獲得了更好的持久性。幾項研究表明，使用早期譜系細胞富集的T細胞群能夠更好地擴增，并提高CAR-T細胞治療的持久性和療效。此外，多項研究表明，在制造過程中向細胞培養物中添加抗氧化劑，如N-乙酰半胱氨酸，也可抑制效應器分化并促進TSCM細胞的擴增。

在CAR T細胞輸注的前幾天，患者接受一種淋巴清除的化療方案，最常見的是環磷酰胺（cy）、氟達拉濱（flu）和苯達莫司?。?/span>ben）。淋巴清除療法根除調節性T細胞（Treg）和其他免疫抑制細胞，增加CAR-T細胞的擴增并延長其持續性。正如在成人B-ALL和B-NHL臨床試驗中觀察到的那樣，充分的淋巴清除對治療成功至關重要，并可能防止CAR的排斥反應。

T細胞耗竭

在TME中，髓源性抑制細胞（MDSC）、癌相關成纖維細胞（CAF）和腫瘤細胞產生的免疫抑制細胞因子的存在會導致T細胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可導致T細胞衰竭，如果抗原刺激持續存在，T細胞會發生一系列表觀遺傳、代謝和轉錄改變，出現耗竭狀態的表征。這種過程以遞進的方式發生，IL-2和TNF-α在早期丟失，IFN-γ和趨化因子分泌在耗竭進展后期減少。盡管高增殖能力也在早期喪失，但在體內受到刺激時，耗竭的T細胞仍能有限增殖。

耗竭的細胞也表現出抑制性受體的高表達，如PD-1、TIM-3、LAG-3、CD160、BTLA、CTLA-4和TIGIT。

表達細胞因子及其受體

第四代CAR T細胞最近被開發出來，用于抵抗TME中的免疫抑制環境，同時克服免疫耗竭。TRUMKS設計將CAR-T細胞的細胞毒性功能與具有免疫調節能力的細胞因子的原位遞送結合起來。在誘導系統的作用下，在CAR結合抗原后，細胞因子被合成，并以自分泌方式發揮作用，以增加T細胞的存活和擴增。細胞因子也可以旁分泌方式發揮作用，調節周圍環境，干擾TME中存在的免疫抑制細胞因子。包括IL-12、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23在內的一系列細胞因子目前正在研究中，并已進入早期臨床試驗階段。

IL-12是一種促炎癥細胞因子，可誘導Th1CD4+T細胞反應，促進CD8+克隆擴增和持續存在。它還負責調節CTL和自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性活性，重新激活無能的腫瘤浸潤淋巴細胞，招募NK細胞，并抑制Treg。對結構性表達IL-12的CD19-CAR-T細胞的臨床前研究表明，它增強了腫瘤殺傷效果和針對癌癥抗原的免疫記憶。然而，與IL-12相關的潛在致命毒性使得有必要開發一種誘導系統，僅在CAR激活時限制IL-12的分泌。一些臨床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在進行和招募中。

IL-15是一種刺激CD8+T細胞和NK細胞活化、增殖和細胞毒性活性的細胞因子。IL-18增加Th1細胞細胞因子的產生，同時抑制IL-10的合成。IL-15和IL-18都是免疫反應的增強劑，已經在CAR-T細胞上進行了測試。與傳統的CAR-T細胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T細胞在荷瘤小鼠中顯示出增強的擴張性和持久性，并且在體外和體內顯示出增強的腫瘤細胞毒性。目前正在招募多項臨床試驗，使用工程化T細胞和NK細胞測試IL-15和IL-18分泌的CAR在實體瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一個CAR-T細胞中共同表達多種細胞因子是可能的。NCT04833504是最近完成的一項臨床試驗，其中在復發或難治性B細胞淋巴瘤患者中檢測表達IL-7和CCL19的CD19+CART細胞，但結果尚未報道。目前正在招募另外兩項臨床試驗，以檢測表達IL-7的CAR-T細胞與PD-1阻斷劑或其他細胞因子的分泌相結合。

聯合檢查點阻斷療法

通過抑制檢查點信號減少耗竭的策略包括通過shRNA表達載體或CRISPR/Cas9敲除共抑制分子。許多研究報告，阻斷檢查點抑制可恢復細胞因子的產生并促進CAR-T細胞存活。此外，同時阻斷多個免疫檢查點，如PD-1、TIM-3和LAG-3，可協同增加CAR-T細胞的效應器功能。

將CAR-T細胞與免疫檢查點阻斷療法相結合可能是增強抗腫瘤活性、持久性和記憶細胞形成的有效策略。在膠質母細胞瘤和乳腺癌細胞系中，抗PD-1抗體增強了抗HER2 CAR-T細胞的抗腫瘤活性。然而，一些臨床試驗報告，在使用PD-1抑制劑和抗GD2 CAR-T細胞聯合治療神經母細胞瘤患者后，結果為陰性。

此外，一些研究已經采用其他策略來阻斷PD-1，例如基因編輯以使CAR-T細胞分泌PD-1阻斷抗體或下調PD-1。

使用干性T細胞

效應T細胞最初被認為是ACT的最佳產品，因為它們具有殺死腫瘤細胞的功效。然而，它們的持久性有限，并且擴增能力很差，很容易發生耗竭。

T_SCM由于其壽命長、自我更新能力強以及在不同T細胞群中的分化能力，是ACT的理想候選。臨床研究表明，輸注表型和功能性T_SCM樣CAR-T細胞（CD62L+、CD28+和CD27+）可產生良好的結果。例如，使用抗CD-19 CAR-T細胞治療的CLL和多發性骨髓瘤患者顯示出與CD27⁺CD45RO^?CD8細胞群相關的良好反應。此外，對小鼠的研究表明，注入富含CD62L+的T細胞群可增加擴增和持久性，從而導致持久的腫瘤消退。

盡管在過去十年中CAR-T細胞治療取得了顯著進展，然而CAR-T細胞在患者體內的有限持久性依然是一個挑戰，主要原因是T細胞耗竭。通過對CAR結構設計，改變生產條件，或引入新的治療方法，我們可能創造抗耗竭的工程化T細胞，從而進一步擴大CAR-T細胞的臨床應用。盡管迄今為止的結果仍然有限，但可能性是無窮的，突破可能即將到來。

參考文獻：

1.Improving CAR T-Cell Persistence. Int J MolSci.?2021 Oct; 22(19): 10828.