CAR-NK細胞的設計

人類自然殺傷(NK)細胞占所有循環淋巴細胞的15%。NK細胞表現出抗腫瘤細胞毒性，無需事先致敏以及細胞因子和趨化因子的作用。由于NK細胞能夠識別和殺死腫瘤細胞，以 NK 細胞為基礎的腫瘤免疫治療領域越來越受到人們的重視。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T細胞治療在血液惡性腫瘤取得了巨大的成就。然而CAR-T細胞仍存在一些不足，例如在實體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數的CAR-T細胞免疫療法需要自體過繼細胞移植，因為除非處理HLA屏障，否則異基因T細胞可能導致移植物抗宿主病（GVHD）；另外，CAR-T細胞免疫治療可能會產生一些副作用，如細胞因子釋放綜合征。

最新的研究表明，CAR-NK細胞可能會克服 CAR-T細胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR-NK細胞在腫瘤的免疫治療中展現出廣闊的前景。

CAR-NK臨床前研究的數量逐年增加，這體現在每年都在增加的關于CAR-NK的研究論文。

此外，在研究的靶標方面，Her2是實體瘤最常用的靶點，而CD19抗原在血液腫瘤中最常見。使用原代NK細胞的研究中，65%的人在研究B細胞惡性腫瘤，CD19是最受歡迎的靶點。有趣的是，在使用NK細胞系的研究中，研究實體瘤是血液惡性腫瘤的2倍以上。

在臨床研究方面， CD19-CAR-NK細胞對血液系統腫瘤有很高的應答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR-NK細胞臨床試驗正在進行中。

還有多項針對實體瘤的研究處于啟動或招募階段。

NK細胞上表達的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結構域、跨膜區以及胞內的信號結構域。胞外結構域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區將這個結構連接到跨膜區，它也在細胞內連接到包含激活信號的胞內結構域。成功的CAR設計是通過仔細的設計和功能測試相結合來實現的。

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉錄調控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉基因的表達水平。目前，對不同啟動子在NK細胞系中的CAR表達和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細胞沒有比較數據。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR-NK細胞的最佳啟動子。

目前關于CAR-NK細胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅動CAR的表達，無論是細胞系來源的還是原代NK細胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質性，這直接轉化為不同水平的蛋白質分泌效率。對于CAR-NK和CAR-T細胞，還沒有確定最佳信號肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細胞最常用的信號肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結合域，該結構域將決定CAR-NK細胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR-NK設計，大多數更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細胞上抗KDR CAR的表達水平。

此外，細胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴大CAR效應細胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉導，誘導兩個CAR結構的表達；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結構中，產生串聯單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術已用于生產CAR-T細胞，但CAR-NK細胞仍未知。

目前大多數臨床CAR-T細胞試驗都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細胞宿主抗移植物病的風險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導宿主抗獨特型免疫反應。幸運的是，在迄今為止數量有限的CAR-NK臨床試驗中，沒有發現與抗CAR免疫反應相關的重大副作用。

連接區

重鏈和輕鏈之間的連接區有助于穩定單鏈抗體的構象，過短會導致多聚體的形成，過長可能導致水解或降低VH和VL結構域之間的關聯。對于CAR-NK細胞，五肽GGGGS的多聚體應用最為廣泛，通常為3個重復。另一個旨在增強蛋白水解穩定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數CAR-NK研究沒有提供連接細節，但已有的研究報道中，有22項使用了G4S連接，有2項應用了218連接。

鉸鏈區

鉸鏈區是連接單鏈抗體單位和跨膜結構域的CAR細胞外結構區，它通常維持效應細胞中穩健的CAR表達和活性所需的穩定性。大多數CAR-NK構建使用CD8α或CD28胞外結構域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區。

鉸鏈區的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數信息全來自CAR-T領域，能否直接轉化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區之間的直接比較中，發現CD28更有可能促進CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區的CAR產生的激活刺激更強。雖然這可能是有益的，但也可能導致更嚴重的副作用。

IgG為基礎的鉸鏈區也廣泛應用于CAR結構。基于IgG鉸鏈區的一個主要優點是結構的靈活性，該結構通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結構域組成。鉸鏈區的長度可以調節以適應抗原識別，但研究發現，間隔區越短，細胞因子的產生越高，CAR-T細胞增殖越快，體內持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR-NK細胞，大多數研究在原代NK細胞（16/35）和CAR-NK細胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區。其它使用的鉸鏈區包括CD28、IgG Fc結構域和DAP12。

跨膜結構域?

跨膜（TM）結構域連接CAR的胞外結構域和細胞內激活信號結構域，CAR-NK最常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結構域的選擇影響了CAR結構在細胞功能上的活化程度。通常在NK細胞上表達的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會導致更多的CD107a脫顆粒和更高的細胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR-NK的活性。

TM結構域的一個重要方面是，最佳TM區域應遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的蛋白質自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強大的NK細胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細胞中最常見，而CD28是CAR-NK細胞系的首選TM區域。

CAR-NK激活信號

CAR的細胞內激活信號的數量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK細胞與CAR-T細胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR-NK臨床試驗采用了第二代CAR-NK構建，該構建通過加入IL-15表達和誘導Caspase9增強活性。

目前大多數CAR結構依賴于CD3ζ鏈信號域，強烈的激活信號對于誘導有效的抗腫瘤反應很重要，但也可能導致效應細胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準所需的免疫細胞反應。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現出更快的效應器特征，誘導更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強烈的共刺激信號也會導致活化誘導的細胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號優先誘導記憶相關基因和持續的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結構域改善了CD28結構域引起的T細胞耗竭。

如上圖所示，在CAR-NK細胞系和原代CAR-NK細胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結構，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是最常用的。

隨著基因修飾技術的進步，許多方法被用于產生CAR-NK。兩種主要方法是病毒轉導（使用慢病毒或逆轉錄病毒），或轉染裸質粒DNA、轉座酶DNA介導的整合以及mRNA電轉。

慢病毒

慢病毒能夠高效地轉導周期性和非周期性細胞，在基因治療領域得到了廣泛的應用。迄今為止，已有14篇關于原代CAR-NK細胞和44篇關于CAR-NK細胞系的研究成功使用慢病毒作為載體。

在臨床前研究中，21項研究使用了第二代病毒，6項研究使用了第三代慢病毒來產生表達CAR的NK細胞系（17個未知）。在原代CAR-NK細胞研究中，5項研究使用了第三代慢病毒，7項研究使用了第二代慢病毒載體（2個未知）。

逆轉錄病毒

幾十年來，逆轉錄病毒一直被用作基因治療載體。迄今為止，有20項使用CAR-NK細胞系的研究和15使用原代NK細胞的研究應用了逆轉錄病毒。最近的一項I期臨床試驗中，由逆轉錄病毒轉導的CD19 CAR-NK細胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。在這項研究中，73%的患者有響應，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內反應迅速。經過一年的隨訪，仍然可以檢測到擴增的CAR-NK細胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數保持穩定達一年之久，這些結果首次表明逆轉錄病毒轉導的CAR-NK細胞可以在體內長期存活。

不同種類的逆轉錄病毒被用來產生CAR-NK細胞。與γ逆轉錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉錄病毒在原代NK細胞的轉導效率上更高。盡管使用不同的逆轉錄病毒可以在NK細胞中獲得長時間穩定的CAR表達，但逆轉錄病毒系統的安全性仍然是一個值得關注的問題，尤其是與更安全的慢病毒相比。

mRNA電穿孔

電穿孔CAR編碼mRNA是一種快速、有效但是作用短暫的一種方法。迄今為止，有9個關于CAR-NK細胞系和11個原代CAR-NK細胞研究使用了mRNA電穿孔。

一般來說，擴增或活化的NK細胞的mRNA轉染效率遠高于新鮮分離的NK細胞。由于mRNA的合成符合GMP的規定，并且電穿孔可以在潔凈室中進行，因此通過mRNA電穿孔產生符合GMP的CAR-NK是可行的。然而，這種方法的主要缺點是CAR表達的窗口短暫：電穿孔后，CAR-NK細胞應在7天內輸回患者體內。

睡美人轉座子

基于轉座子的系統可以在預定的位置高效地導入CAR轉基因，這是傳統方法所不具備的一個重要優勢。轉座子主要通過電穿孔導入NK細胞，然后通過轉座子酶整合到宿主基因組中。有兩項研究應用轉座子系統來產生CAR-NK細胞：一項使用NK-92-MI細胞，另一項研究將轉座子轉染到iPSC細胞，然后分化成NK細胞。富集后，抗間皮素CARs在iPSC衍生的NK細胞上穩定表達，并在卵巢癌小鼠模型中發揮出作用。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一種強大的基因改造技術，這項技術依賴于將Cas9蛋白與引導RNA一起導入NK細胞。最初，這種技術被用于原代NK細胞，以破壞CD38基因，旨在防止NK細胞與daratumumab （抗CD38）聯合使用時的自相殘殺，因為CD38在NK細胞、多發性骨髓瘤和AML細胞上均有表達。

最近，CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些采用HDR模板的研究中，使用K562-mIL-21擴增的NK細胞獲得了超過75%的敲入效率。然而，在新鮮NK細胞中，敲入效率僅為3–16%。總的來說，CRISPR/Cas9策略是一種很有前景的技術，它可以用來精確地刪除、修復或導入特定基因，有望產生強大的抗腫瘤NK細胞。

NK細胞是一類獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受 MHC 限制的細胞毒性、產生細胞因子和免疫記憶等功能。CAR-NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。

目前，對CAR-NK細胞的研究越來越多，基于CAR-T細胞治療的成功經驗，以及新技術和新方法的應用，相信CAR-NK細胞治療一定能夠克服種種挑戰，為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻：

1. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol.?2021; 14: 73.

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