道阻且長，關于“間充質干細胞基礎和臨床”的完美總結

間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）具有強大的體外增殖能力和多向分化潛能。在機體調控下，間充質干細胞能夠不斷地由原組織位點向新組織位點遷移，在生理或病理條件下參與組織的更新和修復，以維持機體組織形態的完整性和功能的穩定性。

間充質干細胞免疫原性較低，一般不會引起宿主的免疫反應。這種特性使其在自身免疫病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應用前景。

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間充質干細胞來源與分布

• 1976年，Freidenstein等首次發現在骨髓里存在一群非造血的骨髓基質細胞，呈克隆性貼壁生長，形態和成纖維細胞相似。由于這些細胞具有多能性，可以分化為中胚層組織，如肌肉、肌腱、韌帶及脂肪組織等。

• 1988年，Freidenstein和Owen 將其命名為骨髓基質干細胞（MSCs）。

• 1992年，Arnold Caplan進一步定義了“間充質干細胞”。“間充質干細胞”的命名被學術界和產業界廣為接受和使用。

• 1995年，Arnold Caplan從惡性血液病患者骨髓分離培養出貼壁的基質細胞，然后輸注到患者體內，觀察臨床效果并驗證其安全性。從此，開啟了第一例間充質干細胞的臨床應用。

• 再后來，Arnold Caplan成了全球第一家間充質干細胞公司——大名鼎鼎的 Osiris Therapeutics 公司的創始人。

• 2012年，加拿大有條件獲批Osiris Therapeutics公司開發的間充質干細胞注射液（Prochymal）作為藥品上市，用于兒童移植物抗宿主病（GVHD）的治療。?

• 2019年，Arnold Caplan教授建議將間充質干細胞改為醫用信號細胞?(medicinal signaling cells，MSCs)，雖然英文縮寫也是MSCs。

圖1：MSCs來源于不同組織[4]

自間充質干細胞的概念提出之后，間充質干細胞的來源組織類型越來越多的被人發現。這就需要對間充質干細胞的定義有一個明確的標準。

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2006年，國際細胞治療協會（ISCT）給出了間充質干細胞定義的最基本定義，也就是間充質干細胞最低的鑒定標準：

然而，不同來源的間充質干細胞表面分子特征差異巨大[3]。雖然不同組織來源的間充質干細胞均能符合國際細胞治療協會（ISCT）制定的最低標準，但依然有不少研究的結果提示不同組織來源的間充質干細胞具有差異性（比如細胞大小、增殖潛能、分泌細胞因子種類和數量，免疫抑制能力也不盡相同）。

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間充質干細胞具有強大的分泌功能，能夠表達、合成和分泌各類生長因子、細胞因子、調節因子、信號肽等多種生物活性分子。間充質干細胞主要有免疫調控，抗細胞凋亡，促進血管生成、支持干/祖細胞的生長和分化、抗疤痕、趨化作用等六大功能。間充質干細胞分泌的活性因子富含諸多生長因子（如VEGF、EGF，bFGF、HGF等），還可分泌諸多細胞因子（IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、GM-GSF、TGF-β等）。

圖3.間充質干細胞的旁分泌功能

間充質干細胞，可產生相應的生長因子和細胞因子在組織修復過程中發生作用，如骨形態發生蛋白（BMP）在骨、肌腱、軟骨的修復中發揮作用，促血管再生因子（VEGF）可用于缺血性疾病的治療。間充質干細胞由于來源廣泛、易獲取、易分離、體外能短時間內大規模擴增、凍存后生物學效力損失很小、免疫原性小、安全性高等特性，已廣泛應用于臨床研究。

間充質干細胞的免疫調節作用

間充質干細胞是一類低免疫原性的成體干細胞，其低免疫原性主要是與其只表達MHC-Ⅰ，不表達MHC-Ⅱ有關。同時，間充質干細胞對各類免疫細胞均具有免疫調節作用。

間充質干細胞對免疫系統的作用以負調控為主。

• 單核細胞：單核細胞可分化為M1型巨噬細胞起促炎作用或分化為M2型巨噬細胞起抗炎作用。MSCs分泌IL-1RA、IL-10、CCL-18促使M1向M2轉化，通過影響Treg的形成，起到抗炎癥與抑制T細胞功能的作用。

• 中性粒細胞：在體內，MSCs能夠通過加強中性粒細胞抗菌能力起到輔助清除細菌的作用，此外還能抑制中性粒細胞凋亡，延長中性粒細胞壽命。

• 樹突狀細胞：作為體內最主要的專職抗原提呈細胞，樹突狀細胞（DC）能夠有效刺激T細胞和B細胞的活化，激發機體免疫應答。體外實驗證實MSCs能夠顯著地減少單核細胞向DC細胞的分化，維持DC細胞的未成熟的狀態，從而使DC不能有效地活化初始T細胞和刺激T細胞增殖。

• T細胞：MSCs主要通過釋放可溶性因子、細胞間的直接接觸以及誘導Treg生成等三種方式抑制T細胞功能，這種抑制作用呈劑量依賴效應。

• B細胞：MSCs主要通過分泌一種細胞因子抑制B細胞增殖，使B細胞的細胞周期滯留在G0/G1期來達到目的。MSCs能夠產生趨化因子受體CXCR4/5/7來改變B細胞的趨化能力。

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圖4. 間充質干細胞的免疫調節作用

間充質干細胞的表面標記物

作為一種異質性細胞群，間充質干細胞并沒有特殊的表面標記物可以表達間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志。不同的表面標記物可能代表間充質干細胞不同的潛能。

眾所周知，間充質干細胞的生物學效力和增殖能力，隨著傳代次數的增加逐漸下降。而標準表面標記物 CD73、CD90 和 CD105 在傳代的早期和晚期均穩定表達，雖然這些標記物也并非間充質干細胞特有的。

圖5?不同表面標記物可能代表?MSCs 的不同潛能

• CD29：CD29（即整合素β1,VLA-β鏈或gpIIa），為多種細胞外基質蛋白的受體，屬于整合素家族。CD29作為纖維連接蛋白受體，參與多種細胞-細胞和細胞-基質相互作用，調節多種重要的生物學功能，包括胚胎發育、傷口修復、止血和防止細胞程序性死亡。它的表達與MSCs的遷移有關。
• CD44：CD44（即Hermes、Pgp1、H-CAM或Hutch），是一種糖蛋白。它表達于白細胞、內皮細胞、肝細胞和間充質細胞。CD44是一種粘附分子，CD44抗原是一種細胞表面糖蛋白，CD44參與多種細胞功能，包括淋巴細胞活化、再循環和歸巢、造血和腫瘤轉移。
• CD73：CD73（即NT5E），是一種5′-核苷酸外切酶。它是一種錨定的表面蛋白。CD73廣泛表達于包括淋巴細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和成纖維細胞在內的多種細胞。CD73不僅可參與嘌呤核苷酸的補救合成途徑，還可作為一種重要的免疫信號分子，參與跨膜信號轉導及細胞的黏附。CD73在間充質干細胞表面的穩定表達是鑒別MSCs重要的表面標記之一。
• CD90：CD90（Thy-1），是一種錨定蛋白。它屬于免疫球蛋白超級家族。人CD90表達于神經細胞、CD34+細胞亞群、胎肝細胞亞群、胎胸腺細胞亞群、成纖維細胞、活化內皮細胞和某些白血病細胞系。Thy-1與與細胞的黏附、分化、細胞間相互作用有關。它是人類微血管內皮細胞活化的標記，與新生血管的形成有關[10]；也是鑒別人類MSCs的重要標記[11]。
• CD105：CD105（即Endoglin），是一種跨膜糖蛋白。在血管生成的組織中，如腫瘤、傷口愈合或真皮炎癥中，CD105在活化的內皮細胞上的表達增加。CD105在血管發生發展過程中起著重要的作用，它可以維持血管的完整性[12]。也是鑒別人類MSCs的重要標記。
• CD146：CD146（即黑色素瘤細胞粘附分子，MCAM），一種具有跨膜結構的黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族成員。CD146在多種細胞生理過程中表現活躍，包括發育、信號轉導、細胞遷移、間充質干細胞分化、血管生成和免疫應答。CD146與MSCs的細胞衰老和“干性”有關，CD146表達逐漸減低，是細胞衰老和干性減弱的一種跡象。
• CD166 ：CD166（即CD6配體或活化的白細胞粘附分子，ALCAM），屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種跨膜糖蛋白。它表達于活化的T細胞、活化的單核細胞、上皮細胞、成纖維細胞和神經元?？赡軈⑴cT細胞的發育和調節，可能在神經系統中發揮作用，在維持MSCs多向分化潛能方面起著至關重要的作用[14]。
• STRO-1：Stro-1也是研究常用的標志物，但在很多研究中均未提及。作為尋找間充質干細胞可靠標志物的實驗研究的一部分。Stro-1曾被認為是著名的MSCs標記物，其抗體主要用于流式細胞術以及對可能的MSCs進行染色。
• SSEA-4：SSEA即階段特異性胚胎抗原，是一種糖蛋白，常表達于胚胎發育早期，在未分化的干細胞中SSEA也常為陽性。SSEA-4是檢測MSCs是否具有干性的一個標記物。

干細胞臨床應用面臨許多挑戰，穩定性和安全性是其中重要因素。干細胞是活的藥劑，對周圍環境高度敏感，因此需要一個嚴格控制的環境，以確保產品（安全，無菌，表面標記物，活性，純度和效力）的公認標準都得到保證。（從細胞收獲到給病人使用的時間）

體外長期擴增可能會導致基因組突變，但并無證據表明衰老與間充質干細胞惡性轉化有關。但出于安全和細胞效力考慮，建議盡量避免使用可能衰老的細胞。通常，間充質干細胞在衰老前，可在體外進行20~40倍擴增。Barkholt 等人建議盡量減少間充質干細胞體外擴增倍數，以降低染色體異常的可能性。ADIPOA-2臨床試驗，就將最終產品細胞擴增倍數限制在7.2倍內（即平皿培養體系中的細胞代數從p1-p16）。

另外，細胞治療產品在臨床應用之前，需要小心保存和加工。避免這些安全性問題，同時又要保留細胞治療的優勢，一種可行方法是使用干細胞分泌組（注：分泌組包含外泌體、外囊泡和其他可溶性細胞因子）來代替細胞進行應用。越來越多的證據表明，成體干細胞的組織再生修復能力主要是由于它們的旁分泌活性因子介導的，這種旁分泌效應是依賴于各種分泌物實現的。

圖6.干細胞分泌組

因此，可以運用干細胞分泌組對疾病（比如燒傷燙傷，銀屑病、系統性硬皮癥、糖尿病足等）進行治療研究。既可以避免干細胞移植存在的免疫反應，也可減少潛在的促瘤性風險，也更容易長期存儲，實現標準化和規模化應用。但是對于干細胞分泌組的穩定性和發揮效果的機理，還需要進一步研究。

間充質干細胞的治療效果的思考

想要提高間充質干細胞的治療效果，必須提高干細胞的歸巢率，那么，細胞如何能夠到達受損部位，是首先要考慮的問題。

1. 細胞質量的考慮

干細胞長期傳代會導致其干性減弱或者丟失，會影響臨床治療效果。在體外培養時間越長，發生老化以及細胞間的氧化損傷積累的可能性就越大，使細胞的增殖能力和歸巢潛能有所減弱。

因此，縮短干細胞在體外擴增時間，有助于提高其歸巢性，增強其臨床效果。在沒有完成規模化制備細胞工藝之前，盡量選擇代數/倍增次數靠前的細胞（在規?；瘶藴驶臈l件下，群體倍增次數才是靠譜的，而細胞代數是實驗室概念，指的是細胞群從培養器皿中移出，再次接種培養過程的次數）。

2. 給藥方式的考慮

干細胞目前常見的給藥方式是循環系統給藥（靜脈注射，動脈注射），局部注射。?靜脈輸注由于操作簡便、侵襲性小、可重復性強，所以治療中最常使用。靜脈輸注是最常用和最簡單的給藥途徑，但存在發生滯留肺部影響效果的可能。肺部能清除超過60%的細胞，造成趨化到損傷部位發揮治療作用的細胞數量減少。

因此，針對某些疾病，如果要想提高療效，盡量會將干細胞“送到”損傷位置進行修復。比如局部注射，腰穿，介入等方法，會提高其歸巢性和發揮更好的里臨床效果。（具體給藥的方式選擇，取決于很多因素，比如適應癥）

局部給藥，包括脊髓鞘內注射（常見于神經系統病變），局部注射（關節腔內注射，椎間盤，心肌注射，肌內注射，氣管注射）；結合生物材料（適用范圍較多，如神經損傷，燒傷燙傷，膝關節炎，子宮內膜損傷，椎間盤等等）

3. 使用凍存細胞還是新鮮細胞

目前使用的細胞有兩種形式：一種是新鮮制備的細胞，一種是冷凍后復蘇的細胞。相對于新鮮制備的細胞，冷凍后復蘇的細胞很多生物學功能沒有恢復。剛復蘇的細胞，歸巢性和存活率都會受到影響，黏附貼壁是移植干細胞存活、生存和有效的前提。研究發現，在移植前使間充質干細胞的處于黏附貼壁狀態，會有利于移植后的細胞生存和向目標組織的歸巢。因此，新鮮制備的細胞要比剛復蘇后的臨床效果要好（但如何進行規?；苽浜烷L距離運輸，建立區域制備中心嗎？）。

4. 細胞移植數量的思考

移植時間及數量影響其歸巢的效果，細胞越早期，移植后歸巢率越高。如果原代細胞數量足夠，不經過體外培養最好。體外培養時間越短，干細胞越容易保持干性，歸巢性會好。剛分離出的細胞往往數量稀少，通常要在體外進行大量培養擴增，以增加干細胞數量。所以，移植時間與細胞數量也是一個矛盾。這意味著，為了獲取足夠數量的原代細胞，體外擴增的時間就會短一些，也會有助于其發揮其臨床效果。

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國際獲批的間充質干細胞產品