干細(xì)胞治療，應(yīng)該選擇第幾代細(xì)胞？

干細(xì)胞技術(shù)是生物技術(shù)的核心內(nèi)容之一。基于干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)或組織再生治療是繼藥物治療和手術(shù)治療之后的又一次醫(yī)療技術(shù)革命，干細(xì)胞治療在疾病的康復(fù)階段具有更加重要的意義。隨著科學(xué)人員的不斷探索，糖尿病、心臟病、阿爾茲海默癥等難治性疾病的治療也迎來(lái)了新的希望。

而在用干細(xì)胞治療疾病中應(yīng)關(guān)注治療時(shí)機(jī)、給藥途徑、細(xì)胞類型選擇、使用數(shù)量等多種問(wèn)題。在多因素之間找到最佳的可行方案，方能助力這項(xiàng)技術(shù)更快落地應(yīng)用。

當(dāng)臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療時(shí)，選擇哪個(gè)代次的干細(xì)胞治療更加合適，是經(jīng)常容易被問(wèn)及的。這些都是應(yīng)該思考和有待解決的問(wèn)題。我們都是知道，人分男女老少，而干細(xì)胞也有年輕和衰老之分，因此，細(xì)胞的代數(shù)是影響干細(xì)胞活性及臨床有效性、安全性的一個(gè)重要因素。

細(xì)胞培養(yǎng)的主要方式是原代與傳代培養(yǎng)。理論上講，細(xì)胞代數(shù)越靠前，干細(xì)胞的干性也越強(qiáng)。但是干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，干細(xì)胞有從組織微環(huán)境到體外培養(yǎng)環(huán)境的一個(gè)調(diào)整和適應(yīng)過(guò)程，一部分不適應(yīng)的細(xì)胞會(huì)被淘汰，所以在前兩三代，干細(xì)胞基因組有著不穩(wěn)定的因素，可能不宜臨床應(yīng)用。

有研究顯示，通過(guò)核型分析發(fā)現(xiàn)，在前三代細(xì)胞中，干細(xì)胞存在異常核型的比例偏高。就如間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）而言，臨床應(yīng)用的最佳代數(shù)應(yīng)該在4~6代。

目前臨床研究中，MSC應(yīng)用較為常見(jiàn)的來(lái)源骨髓、脂肪、臍帶、胎盤(pán)等，本文以臍帶、脂肪、胎盤(pán)這三類比較常見(jiàn)的來(lái)源進(jìn)行總結(jié)，針對(duì)不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，體外傳代培養(yǎng)后不同代次的一些生物學(xué)特性的變化（例如：細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期檢測(cè)、表面標(biāo)記物檢測(cè)、染色體核型分析、相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子的定量分析），因可供參考資料有限，不足之處請(qǐng)諒解。

在各類不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞中, 人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作為更為“年輕”的成體間充質(zhì)干細(xì)胞,具備有出生前和出生后MSC的綜合優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期體外傳代培養(yǎng)后其基本的干細(xì)胞生物學(xué)屬性, 如細(xì)胞表面免疫標(biāo)志物和誘導(dǎo)多向分化潛能, 無(wú)顯著性改變。長(zhǎng)期培養(yǎng)至20代, 未發(fā)現(xiàn)致病性或致瘤性基因變異。高代次(P20)hUC-MSCs的細(xì)胞增殖活性和端粒酶活性與早期低代次(P5)細(xì)胞無(wú)顯著性差異。隨著培養(yǎng)代次的增加, 細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)老化, 尤以20代細(xì)胞表現(xiàn)最為明顯。

同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

體外傳代培養(yǎng)至第5、10代hUC-MSCs呈現(xiàn)完全相同的細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)排列方式, 均呈現(xiàn)長(zhǎng)梭狀貼壁生長(zhǎng), 輕度螺旋流水狀排列。第20代細(xì)胞呈現(xiàn)非常相似的長(zhǎng)梭狀貼壁生長(zhǎng), 但胞體略顯增大, 融合后局部排列紊亂。

已有研究顯示, 雖然高代次培養(yǎng)的hUC-MSCs染色體組型依然保持穩(wěn)定,但至第7代時(shí)其端粒酶活性會(huì)有所下降。我們通過(guò)檢測(cè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性亞單位基因的表達(dá)顯示, 第5、10和20代hUC-MSCs的端粒酶活性之間并沒(méi)有顯著性差異; 且不同代次細(xì)胞呈現(xiàn)相似的生長(zhǎng)增殖曲線, 表明它們的細(xì)胞增殖活力也無(wú)差異性。

不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性檢測(cè)

不同代次(第5、10、20代)的hUC-MSCs以同樣密度接種于6孔培養(yǎng)板中, 每天分別收集3孔不同代次的hUC-MSCs計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。圖示代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

除此以外，因?qū)I(yè)性較強(qiáng)及篇幅有限，類似（常規(guī)核型分析、染色體核型分析、表面標(biāo)記物檢測(cè)、基因表達(dá)和細(xì)胞因子定量分析）就不再贅述了。總言之，雖然第20代hUC-MSCs依然保持與低代細(xì)胞類似的干細(xì)胞生物學(xué)屬性、基因穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特征, 隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)一定程度的老化現(xiàn)象。鑒于過(guò)度的傳代培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致hUC-MSCs出現(xiàn)老化征象, 建議用于干細(xì)胞臨床治療的hUC-MSCs體外培養(yǎng)最好不超過(guò)第10代（現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室基本上都能做到3代以內(nèi)，當(dāng)然也許只是嘴巴上這么說(shuō)）。

間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源豐富，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具備取材方便等優(yōu)勢(shì)，足月的胎盤(pán)是胎兒娩出后的廢棄物，容易獲得并且體積大獲得的數(shù)量多，科研成本低廉，不涉及社會(huì)、倫理等問(wèn)題，而且胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞有類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能和特性，并且具有優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，能夠大量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量。

有研究分別對(duì)P5、P10和P15代細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示P5代間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯高于P10和P15代，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，隨著細(xì)胞代次的增加，細(xì)胞會(huì)逐漸出現(xiàn)的老化。由于胎盤(pán)干間充質(zhì)細(xì)胞在P5代后增殖能力會(huì)逐漸的下降，所以作為臨床應(yīng)用時(shí)最好選擇P5代以下的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。

胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下形態(tài)

圖注：圖中 A 為細(xì)胞貼壁后形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，平行或漩渦狀生長(zhǎng)(×100)；B 為第 25 代細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣改變 (40×4)。?

胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、增殖能力及傳代結(jié)果

圖注：圖中A為P5代細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯短于P10代和P15代細(xì)胞的倍增時(shí)間；圖B為不同代次的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力不同，P5代增殖能力明顯高于P10和P15代，與P5代比，aP

在該項(xiàng)研究中，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞可以長(zhǎng)期傳代到第 25 代，不同代次的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力不同，P5代增殖能力明顯高于 P10 和 P15 代，揭示了臨床應(yīng)用應(yīng)以P5 代之前為宜。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 (adipose?derived?mesenchymal?stem cells，ADSCs)是一類存在于脂肪組織 中具有多向分化潛能的干細(xì)胞。細(xì)胞來(lái)源更加豐富、取材更為方便。而且其免疫原性很低，體外擴(kuò)增也較加容易，這些優(yōu)點(diǎn)使其在組織工程、創(chuàng)面修復(fù)和基因治療等方面具有了更加良好的應(yīng)用前景。

有研究對(duì)ADSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)至 1、3、5、7、l0、14和 15代，發(fā)現(xiàn)ADSCs傳代至第7代后，細(xì)胞增殖速度開(kāi)始減慢 ，10代后細(xì)胞增殖速度顯著減慢。細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形并保持穩(wěn)定。

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細(xì)胞形態(tài)觀察

染色體細(xì)胞核型沒(méi)有明顯易位和缺失等變化，相關(guān)基因表達(dá)量略有差異，培養(yǎng)基內(nèi)分泌的細(xì)胞因子保持穩(wěn)定。

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細(xì)胞因子定量分析

研究表明（利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的）脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在傳代至5代的過(guò)程中，生物學(xué)特性及遺傳特性基本穩(wěn)定，沒(méi)有明顯變化。初步揭示了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代至第5代以內(nèi)可以安全使用?。

通過(guò)以上研究不難看出，間充質(zhì)干細(xì)胞理論上可以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，但在臨床應(yīng)用中不建議選擇代次較高的干細(xì)胞批次。未經(jīng)體外擴(kuò)增的MSC，細(xì)胞本身是安全無(wú)害的，除非本身有某種基因缺陷，體外擴(kuò)增最大的風(fēng)險(xiǎn)在于基因突變。有一研究小組發(fā)現(xiàn)骨髓MSC體外培養(yǎng)至18代時(shí)，出現(xiàn)基因突變、染色體異常。其他大量的研究證實(shí)，MSC在體外培養(yǎng)代數(shù)過(guò)高（超過(guò)10代）的情況下才會(huì)引起染色體異常。

在以往的文章中也有提到，另一個(gè)影響干細(xì)胞回輸安全性的問(wèn)題是添加物，如使用無(wú)血清培養(yǎng)基代替動(dòng)物血清培養(yǎng)；通過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌操作避免抗生素的使用。但對(duì)于胰酶等細(xì)胞培養(yǎng)不可替代的成分，要在回輸時(shí)嚴(yán)格質(zhì)檢以確保其無(wú)成分殘留，也是至關(guān)重要的。

參考資料：

[1]?體外培養(yǎng)傳代人脂肪 、臍帶、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳特性比較研究

[2]?長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

[3]?Best practices in cell culture: an overview

[4]?胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后的增殖能力

[5]?人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代的遺傳特性分析

[6] Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture:considerations for cell therapy