腫瘤精準治療時代：創新免疫療法進入黃金發展階段

作者：北北

以免疫檢查點阻斷和過繼細胞轉移為代表的腫瘤免疫治療在臨床上取得了巨大成功，能夠有效誘導對所有其他治療都無效的一些腫瘤長期消退。其中，以PD-1/PD-L1抑制劑（納武利尤單抗）和CTLA-4抑制劑（伊匹木單抗）為代表的免疫檢查點阻斷療法，在治療各種惡性腫瘤，如非小細胞肺癌、黑色素瘤等，取得令人鼓舞的治療效果。

此外，隨著CAR-T、CAR-M等新型免疫治療方法在血液腫瘤領域的出色表現，免疫治療進入了一個發展的新階段。

雖然近年來涌現出了多種腫瘤免疫治療的新靶點和候選藥物，但大多數仍處于非常早期的發展階段。不幸的是，臨床研究表明，這些候選藥物中的相當一部分可能無法作為單一療法發揮令人滿意的效果。

因此，如何有效探尋不同腫瘤治療手段的聯合治療方案，以及ICB（免疫檢查點抑制劑）和CAR-T治療的臨床療效相關的生物標記物，是當下腫瘤免疫及細胞療法的關鍵所在。

1891年，美國紐約紀念醫院的整形外科醫生William B Coley將活的或者滅活的釀膿鏈球菌混合物注射到腫瘤部位，刺激癌癥病人的免疫系統，治療骨腫瘤，這應該是第一個腫瘤免疫治療案例。在發現特異性免疫細胞和免疫調節分子之前，腫瘤免疫治療的應用幾乎沒有進展。

1974年，白細胞介素（IL）-2被發現在T細胞的分化和生長中起重要的作用。Steven Rosenberg團隊通過IL-2在腫瘤患者中的應用，是現代免疫治療的里程碑事件，并在20世紀80年代促進了其他細胞因子刺激癌癥患者的免疫反應的研究熱度。

然而，直接向患者注射細胞因子可能會導致嚴重的的毒副作用，這就需要發現能夠介導抗腫瘤反應且能夠精準定位腫瘤部位的特異性免疫細胞。

?圖1.?癌癥免疫治療發展的歷史里程碑

T細胞激活是抗病毒和抗腫瘤適應性免疫的關鍵，主要通過雙信號通路實現。

第一信號是抗原特異性信號，涉及T細胞表面受體（TCR）與抗原肽主要組織相容性復合體（MHC）的特異性結合。

第二信號由抗原呈遞細胞（APC）表面的共刺激分子提供，為非特異性協同刺激信號。

如何有效的促進T細胞的活化并對惡性腫瘤細胞進行清除，是腫瘤免疫治療的核心。

圖2.?免疫檢查點抑制劑及其受體列表

免疫檢查點（immune checkpoint ，IC）是一類在免疫細胞上表達的免疫抑制分子，可以抑制免疫細胞激活，因此在自身免疫預防中起著關鍵作用。相反，IC的過度表達抑制免疫功能和有助于腫瘤發生。因此，免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療通過阻斷IC，解除免疫抑制信號，繼而增強抗腫瘤T細胞活性來抑制腫瘤生長。

目前，ICB治療主要是通過兩條IC途徑進行，PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2 通路。

圖3.?PD-1抗體作用機制示意圖

研究發現，PD-1（程序性死亡受體-1，programmed cell death protein-1）能夠抑制T淋巴細胞的功能，這對維持自身免疫耐受是至關重要的。PD-L1（最初被鑒定為B7-H1）在多種類型的腫瘤中高度表達，可以與PD-1結合并介導腫瘤免疫逃避。因此，抑制PD-1可以重新激活T細胞功能。

最近的研究還表明，PD-1不僅在T細胞上表達，而且在NK細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）上也表達，提示PD-1可能在重塑腫瘤免疫微環境甚至全身抗腫瘤免疫反應中發揮非常有效的作用。

PD-1抑制劑可以與PD-1特異結合，從而減弱T淋巴細胞的免疫抑制調節和促使T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞功能的發揮（圖3）。臨床前研究表明，PD-1抑制劑可以抑制腫瘤細胞增殖并誘導各種腫瘤細胞的程序性細胞死亡（凋亡）。PD-1抗體還可以增強由其他細胞毒性藥物（如阿霉素）介導的腫瘤細胞凋亡。

CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein- 4，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4），也稱為CD152，是一種跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T細胞中表達。雖然CD28被發現是一種T細胞共刺激分子，但后來發現CTLA-4雖然與CD28相似，但對T細胞激活起到剎車作用。

在生理條件下，CTLA-4和CD80/CD86結合可以抑制T細胞激活信號并預防自身免疫性疾病的發生。阻斷CTLA-4可以直接靶向效應T細胞的抑制信號，降低Tregs的抑制作用，從而有效增強T細胞的抗腫瘤作用。

1996年，James Allison發現阻斷CTLA-4導致小鼠腫瘤消退。在隨后的人體研究中，伊匹木單抗（CTLA-4抗體）是第一個在臨床研究中應用的CTLA-4抑制劑，成功抑制了難治性轉移性黑色素瘤患者的疾病進展，這是癌癥免疫治療的里程碑。

有趣的是，CTLA-4在黑色素瘤、肺癌和腎癌浸潤的Treg細胞表面高度表達。雖然后來研究發現，Treg清除不是伊匹木單抗臨床抗腫瘤療效的主要機制，但這些結果表明，在某些情況下，CTLA-4抗體也可能抑制TME中的Treg細胞，并有助于免疫激活。

圖4.?CTLA-4和PD-1圖解

雖然PD-1和CTLA-4都是具有代表性的IC分子，但CTLA-4和PD-1以不同方式調節T細胞功能（圖4）。CTLA-4的抑制信號負性調控T細胞的啟動，PD-1主要介導啟動T細胞的隨后激活和增殖。

圖5. PD-1和CTLA-4阻斷后T細胞亞群變化

在抗腫瘤治療方面，以PD-1為靶點的ICB通常會導致現有抗腫瘤T細胞的擴張和招募，而抗CTLA-4治療會產生新的T細胞克隆。此外，抗CTLA-4治療可誘導Th1樣CD4+亞群的增殖，這在抗PD-1治療中未觀察到。這些結果表明，CTLA-4和PD-1可能同時具有協同抗腫瘤作用。

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CTLA-4和PD-1 ICB的聯合治療（納武利尤單抗聯合伊匹木單抗）確實產生了良好的臨床反應，但比單一治療產生了更顯著的不良反應，期待更為有效的協同抗腫瘤方案的出現。

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隨著免疫檢查點CTLA-4、PD-1，及其配體PD-L1的相繼發現，相關抗體藥物的研發也進入到快車道。相繼推動伊匹木單抗、納武利尤單抗、帕博利珠單抗、度伐利尤單抗等免疫檢查點抑制劑問世，將腫瘤治療由化療、靶向治療時代引進到免疫治療時代，開啟了腫瘤免疫治療的新篇章。

與免疫檢查點抑制劑在實體瘤領域的快速進展，在血液腫瘤領域進展迅速的是CAR-T(Chimericantigen receptor T-cell，嵌合抗原受體T細胞)療法。

圖5. CAR-T細胞結構

CAR-T療法屬于過繼性T細胞轉移(adoptive T-cell transfer，ACT)的一種。CAR(嵌合抗原受體)是一種基因工程技術制造的人工受體分子，它可以賦予免疫效應細胞(如T淋巴細胞)針對某個靶點抗原表位的特異性，從而增強T淋巴細胞識別抗原信號與活化的功能，繼而回輸淋巴細胞以實現抗腫瘤，抗病毒或抗炎作用。與免疫檢查點抑制劑一樣，也是依托于T淋巴細胞發揮主要作用。

圖6.?CAR-T治療流程

這種作用機制付諸于臨床實踐，源于技術進步。經過20年T細胞工程的精細調整，能夠通過將識別腫瘤相關抗原（TAA）的scFv和胞內信號域“免疫受體酪氨酸活化基序”（ITAM，通常為CD3ζ）在體外進行基因重組，生成重組質粒，再在體外通過轉染技術轉染到患者的T細胞，使患者T細胞表達腫瘤抗原受體。轉染后經過純化和大規模擴增后的T細胞，就是所謂的CAR-T細胞。

完整的CAR-T結構包括抗原結合區、跨膜鏈接區和胞內信號區三個部分。從而使得T細胞實現了抗原特異性的、非MHC限制的活化及其效應的增強。

目前，CAR-T細胞療法已經實現了5次技術迭代（圖7）。技術的進步，也促進了產品的不斷獲批上市。

圖7. ?CAR-T技術的迭代

2017年8月30日，FDA批準了諾華的第一款CAR-T產品Kymriah，治療3~25歲復發或難治性急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的患者。之后，又批準了其他六種針對白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤的產品。

表1.?可用CAR-T療法列表

目前，約1000項注冊臨床研究正在進行中，涉及的癌種包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、膠質瘤和其他惡性腫瘤等。

盡管取得了上述臨床成功，但CAR-T細胞治療的廣泛應用仍然受到來自不同方面的挑戰。

• 首先，當攻擊腫瘤細胞時，CAR-T細胞可能會引起嚴重的副作用和毒性，這些副作用甚至是致命的。

• 其次，一些CAR-T細胞的細胞毒性不是腫瘤特異性的，可能會對正常組織造成損害。

• 第三，大多數CAR-T細胞產品的制造過程很耗時，這可能導致一些患者在細胞生成窗口期腫瘤進一步惡化。

• 此外，CAR-T治療血癌的長期療效仍需長期隨訪觀察，而CAR-T細胞治療實體腫瘤的應用尚需進一步研究。

這些挑戰將決定未來整個T細胞工程領域的發展方向。

細胞因子釋放綜合征（CRS），也稱為“細胞因子風暴”，是CAR-T治療最常見的不良反應。CAR-T細胞輸注后，IL-6和IL-13的快速升高可引發全身炎癥反應。臨床表現主要包括發熱、疲勞、頭痛、癲癇、惡心、寒戰和呼吸困難。嚴重CRS患者可能會出現急性呼吸窘迫綜合征、低血壓、心動過速、肝損傷、腎衰竭和暴發型噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥（HLH），這些都可能致命。

CRS通常發生在CAR-T輸注后一周內，輸注后1—2周出現峰值。

值得注意的是，在CRS的病理生理過程中，除了活化的CAR-T細胞外，內源性免疫細胞，如單核細胞、巨噬細胞和/或樹突狀細胞，也參與各種細胞因子的合成和釋放以及加重臨床CRS癥狀。

最近，CRISPR/Cas9技術極大地促進了我們對于腫瘤基因組學的理解和腫瘤免疫治療的進展。通過基因組編輯系統，治療性免疫細胞可以被進一步改造以增強腫瘤識別能力和減少衰竭（圖8）。

圖8.?基于CRISPR技術的免疫治療工作流程

2016年，中國四川大學啟動了首次使用CRISPR工程化T細胞的臨床研究；

2020年，一項臨床研究報告使用PD-1敲除T細胞治療放療和化療無效的非小細胞肺癌患者；

這表明CRISPR工程在T細胞中是安全的，這為將CRISRP技術與其他T細胞修飾方法相結合鋪平了道路。利用CRISPR介導的TCR和PD-1基因敲除進行的NY-ESO-1 TCR-T細胞治療是臨床上第一個經過進一步基因修飾測試的腫瘤特異性T細胞。

此外，CRISPR基因編輯系統允許異體T細胞治療的更廣泛應用。能夠有效降低CAR-T的生產成本，價格能夠得到有效降低，未來應用前景廣闊。

ICB雖然已經獲批諸多實體瘤適應癥，然而，并非所有患者都能從ICB治療中受益，因此，確定生物標記物（Biomarker）用于療效預測至關重要。

為了讓患者得到準確有效的治療，以生物標記物進行患者篩選，準確識別有藥物反應的患者，并讓他們盡快接受最佳治療，防止不適當的應用可能導致的疾病進展，是精準腫瘤治療時代下的必然選擇。

表2. 腫瘤免疫治療的生物標志物表單

在ICB治療中涉及的Biomarker包括PD-L1、TMB（腫瘤突變負荷）、MSI-H/dMMR（微衛星高度不穩定性/錯配修復缺陷），這些Biomarker的探索，也源于伴隨診斷技術的進步。

伴隨診斷（companion diagnostic，CD）屬于體外診斷范疇，應用于：一是確定最有可能從某種治療產品中獲益的患者；二是確定因使用特定治療產品而可能增加嚴重副作用風險的患者；三是監測特定治療產品對治療的反應。包括：聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）、高通量測序（NGS）。伴隨診斷技術的進步促進了更多Biomarker 的探索，包括ctDNA，TILs等。

最初探索ICB療效的Biomarker是PD-L1，近年來研究的熱點聚焦在MSI-H/dMMR上，因為MSI-H/dMMR腫瘤患者本身體內的腫瘤新抗原數量較多，理論上免疫是更為獲益的。所謂的腫瘤新抗原，又稱腫瘤特異性抗原（Tumor-specific antigen，TSA） ，是由腫瘤細胞產生的體細胞突變，且僅表達于腫瘤細胞，有比較強的腫瘤特異性和較高的免疫原性。能夠產生新抗原的突變即為具有免疫原性的突變（immunogenic mutation）。

但由于MSI-H/dMMR整體患者的陽性率較低，在泛癌種領域的應用又缺乏大規模循證研究數據佐證，進展較為緩慢。

循環腫瘤基因（循環腫瘤DNA），即ctDNA（ circulating tumor DNA），是近年來新發掘的一種預測免疫療效的biomarker, ctDNA是指腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統，是一種特征性的腫瘤生物標記。通過ctDNA檢測，能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡。

加拿大癌癥中心進行的一項前瞻性二期臨床研究，涉及5種不同類型晚期實體瘤患者接受帕博利珠單抗治療后，ctDNA水平變化與免疫效力之間的關系。結果顯示，ctDNA水平與ICB的療效是相關的。

盡管CAR-T細胞治療B淋巴細胞白血病的初始CR率可能高達90%，但很大一部分患者會出現腫瘤復發。此外，并非所有淋巴瘤或多發性骨髓瘤患者都能通過CAR-T細胞治療獲得滿意的療效，這就促進了與CAR-T細胞療法相關的Biomarker的研究。

最為相關的Biomarker應該是腫瘤抗原的表達，作為靶向治療，CAR-T細胞的性質要求腫瘤細胞表達TAA以激發T細胞活性，這確實是CAR-T細胞治療療效的最關鍵的Biomarker。由于腫瘤抗原逃逸是CAR-T細胞治療后腫瘤復發的主要機制，一些研究還表明，下調而不是完全喪失TAA，會抑制CAR-T細胞功能。

雖然可以設計CAR-T細胞來提高其對低水平TAA的敏感性，但TAA表達密度可能成為預測性Biomarker。

其次，不同CAR-T的產品特征也可作為預測性的Biomarker。治療產品質量的不一致一直是自體CAR-T細胞治療的主要挑戰?；颊咛峁┑某跏疾牧?，經過多次治療后，相關的特征一定會發生改變。因此，與健康獻血者相比，腫瘤患者的T細胞亞群組成表現出更多的差異性。因此，產品質量的差異是影響臨床結果的重要因素。

2018年，Kite Pharma評估了自家的多功能性CAR-T細胞產品，能夠有效的在單細胞水平上產生多種細胞因子釋放的能力，并與淋巴瘤的治療效果相關。

其他一些研究，對輸液產品的表型和轉錄組進行了分析，隨著大規模研究的不斷驗證，這些產品特性可以作為有用的生物標記物，用于預測輸液前的臨床療效。

免疫治療已成為繼手術、化療和放療之后抗腫瘤治療的第四種途徑，以ICB和CAR-T為代表的新型治療手段，已經改寫了諸多瘤種的治療標準，但也存在一定的局限性，如ICB單藥治療患者響應人群數量較低，免疫耐藥現象同樣較高，雙免疫聯合治療方案毒性較大，限制其在臨床大規模的應用等。

CAR-T細胞療法存在生產成本高昂，CRS等毒副反應難以摒除等缺點。隨著腫瘤精準治療時代的到來，基于生物標記物對人群進行細分，更為有效的使用ICB和CAR-T產品，是未來研發的主流方向。期待更為有效的生物標記物在臨床中得到驗證，相關治療毒副反應能夠有效降低，受益患者數量進一步增加。

參考資料：

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