中國間充質干細胞藥物開發流程（上）

近年來，中國對MSCs產品作為藥物管理的規定進行了更新。本文重點關注 MSCs 產品開發過程中的流程和面臨的監管挑戰，目標是為滿足監管需求而提供策略。本文為科學家、生物技術公司和臨床試驗研究人員介紹了一條開發 MSCs 治療產品的成功途徑。

間充質干細胞基本情況

MSCs 來源廣泛，骨髓、脂肪、牙髓、臍帶、胎盤、羊膜、子宮內膜組織、臍帶血、外周血和角膜緣等人類組織都存在 MSCs 。回顧過去二十年，因為 MSCs 在抗炎、促血管生成、免疫調節以及在特定條件下的多系分化能力方面的作用，MSCs已成為最有希望用于臨床治療的候選細胞之一。MSCs 具有免疫豁免屬性，給藥前無需HLA配型。從少量的起始生物材料開始，規模化擴增相對容易。體內研究已經很好地證明了 MSCs 的效力、有效性和穩定性，以支持潛在的臨床應用。

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全世界有超過 800 項注冊的 MSCs 藥品臨床研究和超過 55000 份 MSCs 相關的文獻。目前，人們越來越需要了解 MSCs 作為藥品開發相關的法規問題。?大多數 MSCs 產品，符合2006年國際細胞治療協會（ISCT）定義的 MSCs 的最小標準，包括細胞表面標記物（即CD105, CD73，CD90）的高表達，?與造血細胞相關的標記物（如CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR）的低表達，以及三系分化潛能。細胞標記物在描述給定適應癥的 MSCs 細胞產物時缺乏特異性。盡管，世界上大多數監管機構并不要求將純化的 MSCs 作為臨床產品，但在MSCs 產品開發過程中考慮細胞標記物時，需要確定一致性和純度。

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在美國，根據《公共衛生服務法》（PHS Act; 42 U.S.C. 262）第351條的規定，經過培養擴增的 MSCs 產品需要向 FDA 提交 IND 申請，獲得許可開展臨床試驗。在歐盟，基于 MSCs 的治療產品開發和授權由歐洲藥品管理局（EMA）監管。EMA成立了高級治療委員會（CAT），負責 MSCs 治療產品的審評和許可。在中國，根據現行監管法規，在臨床研究中使用 MSCs?可通過兩種途徑獲得許可。其一，衛健委已經實施了細胞治療產品開展臨床研究的相關法規，批準通過倫理委員會審查合格的指定醫院，進行 MSCs 臨床研究。其二，如果申辦者打算開發 MSCs 藥物，則使用 MSCs 產品的臨床試驗需要根據 NMPA 法規獲得CDE規定的 IND 申請并獲得許可。IND 申請必須由申請人提交，并提供全面的信息（包括細胞和制造工藝的開發、質量標準、質量控制、MSCs產品的穩定性研究、藥效研究、安全性和毒性研究以及臨床試驗計劃和試驗方案）。根據IND申報的規定，MSCs產品必須在符合GMP實驗室生產。

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本文，有助于 MSCs 產品開發者熟悉獲得 IND 申請許可的流程和監管問題。

間充質干細胞產品開發流程

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適用于間充質干細胞產品的法規和指南

• 在美國，MSCs 和其他細胞藥物屬于FDA生物制品評估和研究中心（CBER），特別是細胞組織和基因治療辦公室（OCTGT）的監管，該辦公室依據 CFR 標題 21 第 1271 部分對人類細胞、組織、細胞和基于組織的產品進行監管。
• 在歐盟，MSCs 和其他細胞藥物屬于先進療法藥品（ATMP）的職權范圍，包括體細胞治療藥物、基因治療藥物和組織工程產品。
• 在日本，自 2014 年以來，人類細胞、基因或組織來源的醫療藥品一直受到《藥品和醫療器械法案》（PMD法案）的監管。

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2020年4月26日，NMPA?更新了《藥品生產質量管理規范（GMP）》的生物制品附錄。NMPA 還起草了《藥品生產質量管理規范（GMP）》（征求意見稿）中的細胞治療產品附錄。2020年8月4日，NMPA 還起草了《人源性干細胞及其衍生細胞治療產品臨床試驗技術指導原則（征求意見稿）》。新藥開發，也必須遵循現行《中國藥典》和其他國家藥品標準。此外，2017年，NMPA 加入國際人用藥品注冊技術協調會（ICH），為新的成員，ICH 發布的所有指南都將得到 NMPA 的批準。

因此，藥物研發企業可以參考 ICH 的指南。有關細胞治療的更多可參考美國FDA，歐盟 EMA ，美國注射劑協會（PDA），美國的人體細胞組織優良操作規范（GTP），以及國際制藥工程學會（ISPE）的相關法規和指導文件。

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質控體系的建立與實施

GMP 是一個質量保證體系，用于確保 MSCs 產品的持續生產和控制在適合臨床使用的最先進的質量標準。因此，臨床級MSCs應遵循GMP指南，按照IND法規和質量要求生產藥品。GMP 原則是為了給消費者和患者提供一致質量和高安全水平的產品。為了滿足這些原則，制造商必須建立、實施和維護藥品質量體系。藥品質量體系應監督所有活動（從原材料進廠的控制、生產、測試、人員、設備、標識、生產記錄審查、錯誤檢測和糾正，以及產品最終放行的授權）。確定并實施適當的產品質量改進、工藝改進、可變性降低、創新和藥品質量體系改進，并提高持續滿足藥品質量的管理能力，質量風險管理有助于確定和優先考慮需要持續改進的方向。

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臨床級MSCs產品的制造依賴于訓練有素且符合崗位要求的員工，這是GMP 質量體系的重要組成部分。中國 GMP 的期望是涉及生產和管理各個方面的員工將接受系統的教育、持續的培訓和定期考核，并且負責人應具有具體職責和充分的授權以履行他們的職責。此外，《藥品生產質量管理規范（GMP）》的附錄《細胞治療產品（征求意見稿）》對包括產品生產負責人、質量負責人和質量受權人在內的關鍵員工提出了更高、更詳細的資格要求。

MSCs 產品生產環境和設施的空氣清潔度水平應與產品和生產操作相適應，生產環境和設施不得對原材料、中間體和成品造成污染。MSCs 產品的生產環境和設施應易于、有效的清潔和消毒。此外，MSCs 產品的生產環境和設施必須持續監測。MSCs 產品的生產環境和設施的清潔、消毒、維護和監測操作必須進行定期驗證和持續受制。生產設備的設計、定位和維護應符合其預期的目的和用途。生產、測量、稱重、記錄和控制設備應通過適當的方法和合格的機構在規定的時間間隔內進行維護、校準和檢查。

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CDE 主要通過申請人的文件系統獲得 GMP 合規性。這必須涉及操作和質量管理的所有方面，以便能夠對一系列與產品制造和質量控制相關的所有活動執行審核。此外，《藥品 GMP》（2010年修訂）第8章指出，文件是質量保證體系的基本要素，生產商必須有書面的管理程序、質量標準、技術指南、制劑處方和工藝規程、標準操作程序和內容正確的記錄。企業應建立管理和操作程序的文件管理程序，系統設計、編制、審核、批準和發布文件。質量管理部門應對與本規范相關的文件進行審核。文件內容應與藥品生產許可證和藥品注冊的相關要求一致，并有助于追溯每批產品的歷史記錄。

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物料管理

物料是指用于制造 MSCs 產品的原料或材料（包括細胞、平衡鹽溶液、蛋白酶、血清、培養基、細胞因子、各種添加劑、冷凍保存試劑、轉基因材料、輔料、培養瓶、細胞冷凍保存袋等）。生產物料與 MSCs 產品的質量直接相關，因此，物料管理必須基于良好和標準化的質量保證和評估體系（包括風險評估、關鍵材料制造商和供應商的資格審核、質量放行測試的開發和改進等）。物料的來源、成份、使用、用量和質量控制應清晰合理。在選擇材料時，應考慮必要性、合理性和安全性，并開展工藝去除效果驗證和安全風險評估，必要時應對材料殘留進行測試放行。優先使用已被批準用于人類或符合藥典標準的材料是非常重要的。對于生物來源材料（如FBS和人白蛋白），應進行全面的外源因子檢查，并在技術開發中考慮新外源因子的知識。使用自體細胞治療產品應嚴格防止外源因子擴散的可能風險，材料管理的信息應在 IND 應用程序的 CMC 部分提供，CDE 評審員將確定制造的適用性。

1.? 原料

用于分離和培養 MSCs 的生物材料均來自供者，并需要簽署了醫院醫學研究倫理委員會批準的知情同意書。每個供者都要進行人源病原體的篩查和檢測，尤其是 HIV、HBV 和 HCV 的檢測，所有用于培養擴增所需的起始材料和試劑都需要進行檢測，以便證明材料是無菌和無內毒素的。

細胞分離和培養擴增過程應在 GMP 條件下開展，并經驗證以建立主細胞庫（MCB）。質量控制需要同時實施，確保存儲在主細胞庫的細胞已經進行了無菌、支原體和內毒素檢查和監測。因此，還要制定明確的規范和要求（如細胞表面標記物、優化培養條件、細胞傳代數、生長特性等）。原則上，對于從適合建立主細胞庫的生物材料中分離原代細胞，并有計劃進行細胞檢測、保存和制造。細胞庫的水平可為根據細胞自身特點、生產狀況和臨床應用綜合考慮建立細胞庫檢驗標準，檢驗應滿足安全性、質量可控性和/或有效性的基本要求。

2.? 輔料

MSCs 產品中輔料的使用、劑量和質量應該經過開發和驗證，以證明其使用的必要性、安全性和合理性，并建議優先選擇已批準可用于人類藥品的輔料，否則，輔料的選用需要進行全面的研究和評估，另外，一個更好的選擇是在產品 IND 申請審評過程中對關鍵輔料進行關聯審評審批。?

3.??容器和封閉系統

為了避免因儲存而導致產品質量發生意外變化，生產商應在 MSCs 產品生產過程中對用于樣品儲存和/或成品的包裝容器和封閉系統進行安全評估和相容性研究。為了說明其包裝容器和封閉系統使用的合理性，還應進行其密封性研究和冷凍儲存適用性研究。MSCs 產品的生產過程（如采集的組織或細胞、制備過程中的細胞、成品的輸注等）可能涉及樣品與容器之間短期直接接觸的步驟，生產商同樣應在接觸式容器系統和 MSCs 產品之間進行安全評估和相容性研究。此外，建議在 IND 審評過程中對直接接觸藥品的容器和封閉系統進行關聯審評審批。

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GMP車間的CMC

由于細胞具有在體內存活、自發增殖或/和分化的能力，其臨床研究和質量控制應充分考慮上述基本特征，而 MSCs 產品應符合藥品質量管理的一般要求。臨床樣品的整個制造過程合理，符合《藥品生產質量管理規范（GMP）》的基本原則和相關要求，在生產過程和質量控制中應特別注意人員、環境、設備等要求。MSCs 產品的制造應建立全過程或全生命周期質量保證和控制體系，生產過程應進行嚴格的工藝驗證，并建立明確的關鍵控制點。應嚴格控制生產用材料，并建立和驗證 MSCs 產品生產現場的標準操作流程，以避免生產過程中原材料和生產可能受到外部污染或交叉污染。還應采取有效的隔離措施，防止混淆來自不同供者或不同預期用途的產品。

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1.??制造

MSCs產品的生產過程，是指從供者材料獲得細胞到完成細胞輸入到受者體內的體外操作過程。生產商必須進行工藝開發和驗證，以證明工藝的可行性和可靠性。生產過程中的每一個步驟都需要加以控制，以確保成品符合包括規格在內的所有質量屬性。

工藝驗證，被定義為從工藝設計階段到商業化生產的數據收集和評估，它建立工藝能夠持續交付高質量的產品的科學證據。工藝驗證包括 MSCs 產品和工藝生命周期內發生的一系列活動。工藝設計應避免細胞發生非預期或異常變化，并滿足消除相關雜質的要求。建立技術標準、工藝標準操作規程、關鍵工藝控制參數、內控指標和廢棄物標準，并對整個生產過程進行監控是十分必要的。生產商應繼續優化生產工藝，減少物理、化學或生物效應對細胞特性的非預想效果，并減少雜質（如蛋白酶、核酸酶和選擇性抑制劑的使用）。如果制造過程中存在不連續生產，則應制定并驗證細胞的儲存條件和持續時間。建議采用封閉或半封閉制備工藝，以降低污染和交叉污染的風險。

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整個生產過程的監控，包括關鍵工藝參數（CPP）監測和過程控制指標實現。生產商應根據對整個過程的了解和產品積累經驗的基礎上，明確過程控制中的關鍵生產步驟，制定敏感參數的限定范圍，以避免過程漂移。必要時，還可以對生產過程中的細胞進行質量控制。生產過程中的質量控制和細胞放行檢測相互結合和互補，以實現對整個過程和產品質量的控制。由于供體材料的多樣性，可能含有傳染病病原體，且過程可能造成污染。在 MSCs 產品的整個制造過程中，應特別注意防止微生物污染。

MSCs 產品的劑型、處方和處方工藝應根據臨床用藥要求和 MSCs 產品的穩定性來確定。某些 MSCs 產品在給藥前，需要經歷產品成分物理狀態的轉變、容器的轉換、過濾和清洗、與其它組織材料的結合以及藥物劑量的調整等步驟。因此，還應開發和驗證這些工藝步驟，并在實際產品生產和應用中嚴格執行。應提供有關 MSCs 生產所用組份和材料的制造信息，以及對這些材料進行的檢測匯，應提供制造過程中使用的所有組份的清單。對于異基因細胞，有關供體篩選和檢測的信息應表明所有供體均符合供體標準，MSCs 組織來源和分離、大規模擴增和收集培養必須要詳細說明。細胞庫部分應提供有關歷史、來源、衍生和特性的信息（包括確定細胞安全性、特性、純度和穩定性的檢測）。

IND 申請時，細胞生產過程中使用的所有試劑信息必須列明（包括基礎培養基、細胞因子、生長因子、抗生素、胎牛血清、緩沖液和蛋白酶等）。這些試劑可能會對最終產品的安全性、效力和純度產生影響，并且通常是外源性的。因此，應控制和證明其來源、質量、鑒定以及從最終產品中去除。生產商的質檢報告（COA）、質量標準和申請人的COA必須是材料管理的最重要信息之一。最終產品中存在的輔料也應同樣列出，應詳細說明生產程序，并提供細胞產品的分離、傳代、純化、規模化擴增、收集，產品的制備和分裝和最終產品檢測的流程圖，此外，應詳細說明細胞的制備、工藝時間和中間品儲存以及最終配方。

2.? 產品測試和放行

MSCs 產品的質量研究應在整個開發和規?；a過程，從代表性產品批次和適當生產階段樣品中選擇的樣品上進行。質量研究應涵蓋各種細胞分析，包括功能、純度和安全性，可根據產品特性和屬性添加其他相關研究項目。生產商必須為 MSCs 產品制定質量標準和質量控制策略，MSCs 產品應符合 NMPA 批準的藥品質量標準，即藥品注冊標準。藥品注冊標準應當符合現行《中國藥典》的一般技術要求，不得低于現行《中國藥典》的規定。如果申報的注冊品種所涉及的檢測項目和指標不適用于現行《中國藥典》，生產商應提供充分合理的支持數據，建議采用中間樣品質量檢驗和最終產品放行試驗相結合的機制。

MSCs 產品的分析程序和方法必須經過系統地驗證和確認，申請人應提交分析程序和方法驗證和確認的數據，以支持 MSCs 細胞庫和 MSCs 產品的鑒別、活力、質量、純度和效力的文件。為了達到預期目的，分析程序和方法的典型驗證特性應考慮下列因素：準確度、精度（包括重復性和中間精密度）、特異性、耐用性、檢出限、定量限、線性和范圍。分析報告，應包括原理、設備、操作參數、試劑、參考標準和材料、驗收標準、樣品制備、穩定性、標準制備、試驗程序、系統適用性、計算、數據分析和結論。如果在 MSCs 產品的生命周期內，原材料、生產工藝、法定分析程序、國家標準和自行開發的分析程序發生任何關鍵變化，強烈建議開展再驗證。此外，當生產商提議用替代分析程序替代經驗證的分析程序時，或當分析程序從一個實驗室轉移到另一個實驗室時，要求采用具有可比性的分析方法。目前，分析方法驗證的主要挑戰是中國乃至世界范圍內標準品和參考品的嚴重短缺，因此，為了解決標準品和參考品嚴重短缺的問題，MSCs 產品生產商與標準品和參考品開發機構之間的密切合作是非常必要和緊迫的。

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隨著研究的進展應逐步積累與過程相關的信息，并改進分析程序，以滿足每個階段的質量控制要求。質量控制一般應考慮鑒別試驗（細胞形態、表型、細胞標記等）、生物功效、純度、雜質、細胞數（活細胞數、功能細胞數等）、細胞生長活性、細胞周期、細胞倍增時間、克隆形成率和一般檢測（如無菌檢測、支原體、內毒素、端粒酶的表達和活性等）。應以細胞類型為基礎進行細胞特性研究（包括細胞形態、細胞表面標志物、基因表達、細胞分化、表面標志物表達、效價測試、分泌組的定性和定量測量，以及過程中添加成分的殘留量檢測）。

應基于細胞的性質、特征和預期用途，建立 MSCs 產品功能研究的分析程序。為建立合理有效的生物功效分析程序，作用機制應與臨床適應癥一致，就細胞純度而言，建議檢測細胞亞群和活力。雜質研究應包括細胞加工（如蛋白酶、動物血清蛋白、重組蛋白和細胞因子等）以及最終細胞產物（如死細胞殘留物和其他可能的生物降解產物等）。應根據細胞來源和工藝的特點考慮安全相關研究，并可針對外源病毒因子、細胞惡性轉化的可能性、遺傳穩定性、成瘤性和致瘤性等進行考慮。

有關細胞給藥過程的模擬研究應該進一步開發和完善。如果在醫院的研究中心進行?(細胞恢復、產品稀釋等)，申請人應建立標準操作程序，并對臨床研究人員進行良好的培訓。強烈建議在完成給藥操作前完成標準化工藝驗證試驗以驗證最終產品質量（如細胞形態、細胞表型、多系分化效力、細胞數量和存活率、外觀、效力、特性、無菌性、支原體、內毒素，其他外源性物質等）。效力評估，用于證明臨床研究的所有階段和市場批準后使用符合預定的規范或接受標準的產品批次。一般來說，對于細胞和基因治療產品，沒有單一的檢測方法可以充分評估預測臨床療效的產品屬性，因此，開發多個屬性檢測來評估細胞和基因治療產品的效力是必要和可取的。

每一批產品都應該進行放行檢驗，最終產品的質量標準應在 IND 中明確設置，通常采用表格格式，最終放行檢驗數據最好是在 MSCs 產品臨床使用之前提供。所有產品從細胞收集到臨床給藥必須是可追蹤和可識別的，并貼上適當的標簽。

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MSCs產品的穩定性研究

推薦 MSCs 產品的生產采用連續工藝。對于生產過程中需要臨時儲存的樣品，應進行儲存穩定性研究，以支持其儲存條件和儲存期限。為了證明最終細胞產品在研究所需時間（從最終放行到給藥）足夠穩定穩定性試驗是必須要進行的，并應注明最終產品的有效期。MSCs 產品穩定性研究的基本原則，可以根據產品自身特點、臨床用藥需求以及存儲、包裝和運輸的運輸條件，制定合理的研究計劃。研究應使用具有代表性的細胞樣本和存儲條件進行。此外，還應開發和優化最終產品運輸方案，并對方案穩定性進行驗證。此外，還應驗證給藥前的產品準備程序以確認最終產品質量合格。

—? 未完待續 ?—?

作者：趙欽軍??韓之波? 王家倫 *??韓忠朝*

單位介紹：天津昂賽細胞基因工程有限公司是國家發改委批準組建的細胞產品國家工程研究中心項目的法人單位。公司創始人韓忠朝教授是法國國家醫學科學院和法國國家技術科學院兩院院士，引領了我國干細胞產業化發展方向，其團隊專注于干細胞藥物研發，在國內研發的2款產品目前已經有5個適應癥獲得CDE默示許可。