穴位電針和 iPSC-EVs 治療可以減少缺血性卒中小鼠的梗死體積、改善運動功能和神經(jīng)功能，并抑制神經(jīng)元凋亡。

2022 年 3 月Cells發(fā)表一篇題為herapeutic Potential of a Combination of Electroacvupuncture and Human iPSC-Derived Small Extracellular Vesicles for Ischemic Stroker（電針和人 iPSC 衍生的小細胞外囊泡聯(lián)合治療缺血性中風(fēng)的治療潛力）的文章，作者來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科Peiying Deng、Liang Wang等。

 

電針療法：電針療法是指在刺入人體穴位的毫針上，用電針機通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。電針是在針刺腧穴得氣后，在針上通以接近人體生物電的微量電流以防治疾病的一種療法。它的優(yōu)點是：在針刺腧穴的基礎(chǔ)上，加以脈沖電的治療作用，針與電兩種刺激相結(jié)合，故對某些疾病能提高療效；能比較正確地掌握刺激參數(shù)；代替手法運針，節(jié)省人力。

 

缺血性腦中風(fēng)：缺血性腦中風(fēng)、腦血栓、腦栓塞、腔隙性缺血性腦中風(fēng)和多發(fā)性缺血性腦中風(fēng)及小中風(fēng)都屬于缺血性腦中風(fēng)，就是指腦血管狹窄或閉塞，導(dǎo)致腦血流阻斷而使腦組織發(fā)生缺血缺氧、軟化甚至壞死，致使腦血管功能障礙，引起相關(guān)癥狀。缺血性腦中風(fēng)是腦血管疾病的主要類型，約85%的腦中風(fēng)是缺血性的。據(jù)《2018中國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒》，全國缺血性腦中風(fēng)現(xiàn)患病人數(shù)高達1242萬。

 

穴位電針+外泌體聯(lián)合治療缺血性腦中風(fēng)

 

北京協(xié)和醫(yī)院的研究人員在Cells的這篇文章，探討了電針（EA）聯(lián)合誘導(dǎo)多能干細胞衍生的小細胞外囊泡（iPSC-EVs）對缺血性卒中小鼠的作用及其潛在機制。

 

通過大腦中動脈閉塞（MCAO）在C57BL/6小鼠中建立局灶性腦缺血模型。研究人員發(fā)現(xiàn)3天后，通過行為測試檢查神經(jīng)損傷和運動功能。使用TTC染色和TUNEL測定檢查梗塞體積和神經(jīng)元凋亡。進行流式細胞術(shù)以評估T淋巴細胞的增殖。通過免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡評估白細胞介素 (IL)-33/ST2 軸的變化。

 

最終發(fā)現(xiàn)，細胞外囊泡和 iPSC-EVs 治療的組合改善了 MCAO 小鼠的神經(jīng)損傷并減少了梗塞體積和神經(jīng)元凋亡。電針加 iPSC-EV 抑制 T 輔助細胞 (Th1) 和 Th17 反應(yīng)并促進調(diào)節(jié)性 T 細胞 (Treg) 反應(yīng)。

 

此外，電針加 iPSC-EVs 通過調(diào)節(jié) IL-33/ST2 軸和抑制小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化發(fā)揮神經(jīng)保護作用。該研究表明電針和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中發(fā)揮了協(xié)同神經(jīng)保護作用，這種治療可能代表了一種新的有效治療缺血性中風(fēng)和其他組織損傷的方法。

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缺血性中風(fēng)導(dǎo)致患者出現(xiàn)永久性殘疾

 

缺血性中風(fēng)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致全世界患者出現(xiàn)永久性殘疾。缺血性卒中誘發(fā)的神經(jīng)炎癥在導(dǎo)致卒中后繼發(fā)性腦損傷的多種機制中發(fā)揮著重要作用。目前的臨床最佳治療是靜脈溶栓或血管內(nèi)血栓切除術(shù)，但兩者都對時間關(guān)鍵性要求較高。因此，必須開發(fā)一種新的治療方法來減少缺血再灌注損傷。

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T 淋巴細胞是缺血性中風(fēng)誘發(fā)的神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。T 輔助細胞 1 細胞 (Th1) 促進炎癥，Th2 細胞優(yōu)先誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)。因此，Th1/Th2 平衡可以提供對炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的深入了解。

此外，之前的一項研究顯示，缺血性卒中患者的 Th17 細胞顯著增加，外周調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細胞顯著減少，這表明外周 Th17/Treg 失衡可能是缺血性卒中發(fā)病機制的基礎(chǔ)。

 

最近的研究還報道了小鼠大腦中 Treg 細胞數(shù)量的上調(diào)，這些細胞可能促進中風(fēng)后的功能恢復(fù)和大腦修復(fù)。因此，對 T 淋巴細胞的作用進行更深入的研究對于缺血性卒中治療至關(guān)重要。

 

誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)帶來的醫(yī)學(xué)變革

 

自 2006 年發(fā)現(xiàn) iPSC 技術(shù)以來，誘導(dǎo)多能干細胞 (iPSC) 已成為腦血管疾病治療中最有希望的干細胞來源之一，因為它們在組織再生、自我更新能力和分化方面具有巨大優(yōu)勢潛在的。

 

盡管 iPSC 的管理受到低植入率和潛在的腫瘤發(fā)生風(fēng)險的限制，但最近的研究證明，移植干細胞的有利作用很大程度上歸因于它們釋放的外泌體，因為外泌體具有低免疫原性，低毒性，以及穿過血腦屏障的能力。外泌體的給藥已被用作缺血性中風(fēng)的治療方法。

 

據(jù)報道，M2 小膠質(zhì)細胞分泌的外泌體可改善缺血性腦損傷并促進神經(jīng)元存活。一項研究還報道，間充質(zhì)干細胞 (MSC) 衍生的外泌體有利于中風(fēng)后的神經(jīng)元重塑和功能恢復(fù)。

 

根據(jù)越來越多的證據(jù)，外泌體通過其貨物（包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸）改善了缺血性卒中治療的功能結(jié)果。最近的一份報告證實，源自 iPSC 產(chǎn)生的神經(jīng)元的外泌體可促進神經(jīng)發(fā)生并調(diào)節(jié)神經(jīng)回路的發(fā)育。這些觀察結(jié)果表明，iPSC 衍生的小細胞外囊泡 (iPSC-EVs) 的應(yīng)用可能是一種有前途的中風(fēng)治療方法；然而，它們的細胞目標仍然不明確。

 

電針：傳統(tǒng)針灸和電刺激的技術(shù)

 

電針（EA）作為一種結(jié)合傳統(tǒng)針灸和電刺激的技術(shù)，已被用于中風(fēng)和中風(fēng)后的康復(fù)，因為它可以改善神經(jīng)功能障礙而沒有明顯的副作用。研究表明，電針治療可有效減輕炎癥損傷并在缺血性中風(fēng)中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

 

因此，電針和iPSC 衍生的小細胞外囊泡 （ iPSC-EV） 都是有前景的中風(fēng)臨床治療策略。有關(guān)研究報道了“百會”（GV20）和“足三里”（ST36）穴位的電針治療可以減輕大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠的神經(jīng)元損傷。然而，電針和 iPSC-EVs 調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的具體機制仍不清楚。

 

因此，北京協(xié)和醫(yī)院等研究人員研究探討了穴位電針 治療和 iPSC-EVs 組合對腦缺血性損傷的潛在影響，發(fā)現(xiàn)穴位電針和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中調(diào)節(jié) IL-33/ST2 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

 

研究結(jié)果

 

1.穴位電針和 iPSC-EV 聯(lián)合治療可改善缺血性中風(fēng)后的運動功能障礙

 

研究人員使用 MCAO 小鼠模型來確定電針和 iPSC-EVs 對缺血性中風(fēng)小鼠運動功能的影響（詳細的穴位位置如下圖所示）。將小鼠分為六組，rCBF 在缺血前和缺血期間以及再灌注后 5 分鐘進行監(jiān)測。rCBF 減少在整個閉塞期間保持穩(wěn)定，并在所有組中移除燈絲后立即恢復(fù)到缺血前水平。首先，使用局灶性神經(jīng)量表評估小鼠的神經(jīng)損傷。MCAO組的Clark評分顯著高于假手術(shù)組。用 EA、iPSC-EV 或兩者治療后，Clark 評分顯著降低，表明神經(jīng)損傷顯著減輕。假針灸治療在 MCAO 后沒有改變分數(shù)。圓柱體和開放場測試也表明 EA、iPSC-EV 和 EA + iPSC-EV 組中的小鼠在 MCAO 后 72 小時的運動表現(xiàn)出顯著改善。特別是電針+iPSC-EVs組表現(xiàn)出更顯著的改善，表明電針聯(lián)合iPSC-EVs治療對改善缺血性腦損傷后的神經(jīng)功能和運動功能有更好的效果。

 

2.EA 和 iPSC-EVs 治療可減輕缺血性腦損傷

為了確認 EA 和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中的作用，用 TTC 染色檢查梗塞體積，并用免疫熒光分析神經(jīng)元凋亡。在 MCAO 組中，缺血誘導(dǎo)的梗死體積在中風(fēng)后 72 小時顯著增大。令人驚訝的是，用 EA 和 iPSC-EVs 治療顯著減少了缺血誘導(dǎo)的梗塞體積，而假針灸治療對梗塞體積沒有影響。

此外，與 MCAO 小鼠相比，EA 治療小鼠的皮層梗塞體積減少了 15.5%，紋狀體減少了 12.6%，整個半球減少了 14.5%，而 iPSC-EVs 治療和 EA+iPSC- EVs 治療的小鼠，皮層的梗死體積分別減少了 14.4% 和 24.7%，紋狀體減少了 9.3% 和 18.9%，整個半球分別減少了 11.4% 和 26.5%。此外，梗死面積的減少并未偏向特定水平。

另外，TUNEL 試驗的結(jié)果證實，與假小鼠相比，MCAO 小鼠梗塞核心區(qū)域的神經(jīng)元凋亡顯著增加，并且用 EA+iPSC-EVs 治療的小鼠的神經(jīng)元凋亡幅度顯著降低。EA 和 iPSC-EVs 組之間沒有顯著差異，但在 EA 和假針灸組之間觀察到顯著差異。總之，EA 或 iPSC-EV 可減輕 MCAO 小鼠模型中缺血引起的腦損傷，并且 EA 與 iPSC-EV 聯(lián)合的整體治療效果優(yōu)于其他兩種藥物。

 

3.EA 和 iPSC-EVs 治療調(diào)節(jié) MCAO 小鼠中 Th 細胞的增殖

 

研究人員使用流式細胞術(shù)檢測了 MCAO 后 72 小時小鼠外周血中 Th 細胞亞群的表達情況探索 EA 或 iPSC-EVs 是否調(diào)節(jié) MCAO 誘導(dǎo)的 T 細胞免疫反應(yīng)。MCAO 后 IFN-γ+ Th 細胞和 IL-17+ Th 細胞的水平顯著增加，而這些異常增加在 EA-、iPSC-EVs-或 EA+iPSC 中顯著抑制-EVs 治療的動物，盡管 EA+iPSC-EVs 組的減少明顯更大。

 

三個治療組之間沒有顯著差異，但在電針組和假針刺組之間觀察到顯著差異。相比之下，EA 和 iPSC-EV 的組合在防止 MCAO 誘導(dǎo)的 Foxp3+ Treg 細胞數(shù)量減少方面發(fā)揮了顯著的協(xié)同作用。在 MCAO 之后，IL-4+ Th 細胞的數(shù)量在任何組之間沒有顯著差異。基于這些結(jié)果，EA 和 iPSC-EVs 治療的組合是調(diào)節(jié) MCAO 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的更有效的治療方法。

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4.EA 和 iPSC-EVs 治療調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞中 IL-33/ST2 的激活

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IL-33 通過與星形膠質(zhì)細胞或小膠質(zhì)細胞表面的 ST2 受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥。進行免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡以評估 EA 和 iPSC-EVs 對 IL-33/ST2 活化的貢獻。

 

與假對照小鼠相比，MCAO 小鼠病變部位的 IL-33 免疫反應(yīng)細胞數(shù)量和 IL-33 蛋白水平均顯著增加。與單獨使用 EA 或 iPSC-EVs 治療相比，EA+iPSC-EVs 治療對 MCAO 誘導(dǎo)的 IL-33 表達增加具有更好的抑制作用。

 

盡管 EA 和 iPSC-EVs 治療在 72 小時顯著抑制了 MCAO 誘導(dǎo)的梗塞區(qū)域 IL-33 的上調(diào)，但這些治療之間沒有觀察到顯著差異。

 

一致地，GFAP 染色顯示 MCAO 誘導(dǎo)的腦中 IL-33 表達伴隨著 MCAO 小鼠星形膠質(zhì)細胞的激活，并且這種變化通過 EA、iPSC-EV 或 EA+iPSC-EV 治療顯著緩解。這種效果在 EA+iPSC-EVs 治療的小鼠中更為顯著，而接受假針灸治療的小鼠與 MCAO 小鼠沒有差異。

 

此外，免疫熒光結(jié)果反映 IL-33 位于星形膠質(zhì)細胞中。ST2 表達的趨勢相似，因為 MCAO 后 72 小時病變部位 ST2 表達增加被 EA 和 iPSC-EVs 治療逆轉(zhuǎn)，尤其是在 EA+iPSC-EVs 治療的小鼠中；假針灸治療沒有這種效果。這些發(fā)現(xiàn)表明，EA 聯(lián)合 iPSC-EVs 治療通過促進星形膠質(zhì)細胞中的 IL-33/ST2 軸激活來調(diào)節(jié) T 細胞反應(yīng)。

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5.EA 和 iPSC-EVs 治療可防止腦缺血引起的小膠質(zhì)細胞活化

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最近的一項研究證實了腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞形態(tài)和功能的一系列變化。小膠質(zhì)細胞以其“靜止”狀態(tài)存在，其特征在于分枝形態(tài)。活化的小膠質(zhì)細胞在形態(tài)上發(fā)生顯著變化。缺血再灌注后，梗死區(qū)小膠質(zhì)細胞迅速增殖并活化，活化的小膠質(zhì)細胞周核逐漸變大，分支減少。

 

研究人員應(yīng)用免疫熒光染色在 MCAO 后 72 小時檢測小膠質(zhì)細胞表型標志物，并驗證 EA 和 iPSC-EVs 是否也抑制小膠質(zhì)細胞活化。MCAO 導(dǎo)致 Iba1+ 細胞總數(shù)和活化的 Iba1+ 細胞數(shù)量顯著增加，而在 EA-、iPSC-EVs- 和 EA+iPSC-EVs 處理的小鼠中，這種增加被顯著抑制，尤其是在接受 EA+iPSC-EVs 組合的小鼠中治療。

 

相反，在 MCAO 后觀察到靜息 Iba1+細胞的數(shù)量顯著減少，并且這種趨勢通過 EA 或 iPSC-EVs 治療得到顯著阻止，尤其是在 EA+iPSC-EVs 組中。因此，EA 和 iPSC-EVs 治療也抑制了 MCAO 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化。

 

結(jié)論與展望

 

缺血性中風(fēng)會促進活性氧 (ROS) 和氧化應(yīng)激的增加，從而導(dǎo)致促炎細胞因子的產(chǎn)生。神經(jīng)炎癥是局灶性腦缺血的主要后果，并導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。

 

在目前的研究中，北京協(xié)和醫(yī)院的科學(xué)家們研究了 iPSC-EV 和 EA 的神經(jīng)保護作用，并使用 MCAO 小鼠模型探索了可能的機制。用 iPSC-EVs、EA 或兩者的組合治療大大減輕了缺血引起的腦損傷。iPSC-EVs 和 EA 的治療效果與通過調(diào)節(jié) IL-33/ST2 通路抑制炎癥有關(guān)。

 

使用 iPSCs 的基于細胞的治療是減輕缺血性腦損傷的一種潛在的有前途的方法。然而，iPSCs 的使用可能會受到其致瘤潛力的影響。根據(jù)最近的研究，干細胞的積極貢獻主要是通過其旁分泌機制，而 EV 在此過程中至關(guān)重要。

 

干細胞衍生的外泌體技術(shù)在多個領(lǐng)域取得了長足的進步。iPSC-EVs 的治療優(yōu)勢已在多種疾病中得到證實，例如肝缺血再灌注損傷和急性心肌缺血再灌注，這些研究記錄了令人鼓舞的結(jié)果。然而，iPSC-EVs 治療缺血性腦中風(fēng)（卒中）的機制需要更多的研究。

 

電針作為一種經(jīng)濟、方便的治療方法，可用于緩解缺血性腦卒中癥狀。由于疾病的復(fù)雜性，與單一穴位相比，穴位組合增加了電針的療效。如之前的研究所示，“百會”（GV20）和“足三里”（ST36）穴位組合的電針通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和改善MCAO大鼠線粒體功能損傷，對減輕神經(jīng)元損傷發(fā)揮協(xié)同保護作用。

 

研究人員證明了兩個穴位的組合在 7 天內(nèi)提供了對腦缺血性損傷的顯著保護，尤其是在第 3 天。因此，在該項研究中，研究人員專注于評估 EA 和 iPSC-EVs 治療對 MCAO 動物的作用接受治療3天。

 

中醫(yī)理論認為，頭部的GV20與大腦密切相關(guān)，常用于治療腦部疾病。另一個穴位ST36被認為可以豐富身體的能量。GV20+ST36 的有效性可能主要歸因于穴位的局部和遠距離效應(yīng)的結(jié)合。研究表明，ST36 處的刺激導(dǎo)致的腦電圖和功能磁共振成像 (fMRI) 模式與針刺兩個非穴位不同，而腦 fMRI 為穴位特異性提供了證據(jù)。目前的研究為穴位特異性提供了分子證據(jù)。

 

在這項研究中，研究人員將 iPSC-EV 注射到小鼠的尾靜脈中，并研究了它們對有或沒有 EA 刺激的小鼠大腦的損傷修復(fù)作用。單獨的 iPSC-EV 和單獨的 EA 均減少了 MCAO 小鼠的梗塞體積（TTC 染色）、增強的神經(jīng)功能（Clark 評分）、改善的運動功能（圓柱試驗和曠場試驗）和抑制神經(jīng)元凋亡（TUNEL 試驗）。

 

此外，iPSC-EV 和 EA 的組合效果最好。研究人員認為，與單獨使用 iPSC-EV 或 EA 相比，EA 與 iPSC-EV 的組合可能是一種更有效的修復(fù)腦損傷的方法。與以往的研究相比，EA 和 iPSC-EVs 的組合對缺血性損傷具有協(xié)同的神經(jīng)保護作用。值得注意的是，所選穴位因疾病而異。

 

此外，電針對不同人群的作用受吸煙、肥胖、年齡和糖尿病等多種因素的影響。因此，在治療不同的疾病時，電針的持續(xù)時間和作用機制也不同。

 

無疑，T淋巴細胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與缺血性卒中密切相關(guān)。在其他研究中，腦卒中后 24 小時內(nèi)浸潤的 T 淋巴細胞在腦中增加，并在第 3 天左右達到峰值。Th1 和 Th2 之間的不平衡似乎是中風(fēng)的一個關(guān)鍵因素。IL-17 水平升高和 Treg 數(shù)量減少與卒中發(fā)病直接相關(guān)。在該研究中，iPSC-EVs 和 EA 治療通過促進 Treg 反應(yīng)和抑制 Th17 和 Th1 反應(yīng)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

 

穴位電針和 iPSC-EVs 治療可以減少缺血性卒中小鼠的梗死體積、改善運動功能和神經(jīng)功能，并抑制神經(jīng)元凋亡。該研究結(jié)果揭示了 iPSC-EVs 和 EA 通過調(diào)節(jié) IL-33/ST2 介導(dǎo)的炎癥和小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活對缺血性腦損傷具有協(xié)同神經(jīng)保護作用。該研究提出了一種新的缺血性腦損傷治療方法，并為應(yīng)用電針和iPSC-EVs聯(lián)合治療不同類型的組織損傷提供了研究基礎(chǔ)。（本文由干細胞與外泌體編譯，原為英文如編譯有誤請在評論區(qū)留言）