·研究背景·
新冠疫情爆發以來，多種不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、滅活病毒等)在全世界的抗疫中發揮了重大作用。然而現有的疫苗也有一些局限性，如儲存運輸條件苛刻、需要接種加強針、對突變病毒不敏感等等。最近，bioRxiv發表了一篇基于細菌外泌體的新型新冠疫苗對疾病保護作用的文章，或許可以為新冠疫苗的研發提供新的思路。
·研究進展·
Jiang和Driedonks等[1]通過對細菌來源的外囊泡表面修飾病毒S蛋白的受體結合結構域（RBD）制成了新型新冠疫苗。革蘭氏陰性菌能夠產生外膜囊泡（OMV），在哺乳動物體內具有免疫刺激作用，可誘導免疫應答發生并激活樹突細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞，而經過改造的工程菌產生的OMV內毒性非常低，避免了不良反應的發生。作者使用了一種鼠傷寒沙門氏菌株，通過Spycatcher/Spytag體系使該菌株分泌的OMV通過共價鍵穩定結合了病毒的RBD（圖1）。
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圖1 （A）RBD重組抗原的設計，RBD連接到SpyTag的N端和C端；
（B）RBD修飾的OMV示意圖。
研究人員在RBD-OMV制備完成后，使用全自動外泌體熒光檢測分析系統Exoview檢測OMV表面是否成功結合了病毒RBD。其中，檢測芯片上包被了D001, D003, MM43三種病毒S蛋白以及LPS的抗體，分別用于捕獲RBD-OMV和所有OMV；捕獲完成后使用熒光抗體標記對D001, D003, MM43進行表型分析。最后，使用Exoview的SP-IRIS無標記成像技術檢測了OMV是否被成功捕獲，并通過熒光成像統計捕獲的不同表型OMV的數量。
圖2 RBD-OMV捕獲數量及表型檢測。A：SP-IRIS技術檢測不同抗體捕獲的OMV數量；B：熒光檢測不同表型OMV數量。
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圖3 對照組捕獲數量及表型檢測。A：SP-IRIS技術檢測不同抗體捕獲的OMV數量；B：熒光檢測不同表型OMV數量。
圖4 RBD-OMV與對照組的捕獲的不同表型OMV數量對比。
圖2A顯示S蛋白抗體和LPS抗體均捕獲到了數量相當的OMV，表示OMV以很高的效率成功結合了新冠病毒的RBD。圖2B的熒光標記結果也證明了結合成功，但是結合D003的OMV數量相對較低。圖3A和圖3B的對照組結果表示僅有LPS抗體能夠捕獲到OMV，并且幾乎沒有熒光標記，表面對照組OMV上沒有結合RBD，將RBD-OMV與對照組的數據統計對比（圖4），說明RBD-OMV疫苗的特異性非常好。
·疫苗效果驗證·
RBD-OMV疫苗制備完成后，研究人員使用倉鼠模型對疫苗接種的效果進行了檢測。實驗分為三組：接種疫苗的實驗組（RBD-OMV），接種溶劑的溶劑對照組（mock）和接種未結合RBD的OMV的空白對照組（Ctrl-OMV）。研究人員對不同組別分別接種后，使用病毒感染倉鼠，并進行了一系列測試以驗證疫苗效果。
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圖5 RBD-OMV與mock、Ctrl-OMV的體重。A&B：接種完成后，病毒感染前的體重記錄；C&D：病毒感染后的體重變化。
體重檢測結果顯示，在病毒感染前，三組倉鼠的體重，無論雄性和雌性，隨時間均沒有顯著改變（圖5A&B）；病毒感染后，RBD-OMV組體重沒有下降，而mock與Ctrl-OMV組體重下降，在第三、四天達到顯著（圖5C&D）。
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圖6
A：接種后Day42的抗S-RBD IgG滴度；B：抗S-RBD
IgG滴度隨時間的變化；C&D&E：Day48的BAL中抗S-RBD
IgG/IgM/IgA的滴度；F：病毒中和抗體測試的中和抗體滴度隨時間的變化；G：Day35 WT和Delta病毒株的中和抗體滴度比較。
血漿S-RBD
IgG滴度測試結果顯示，接種后42天，RBD-OMV組的血漿S-RBD
IgG滴度更高，而兩個對照組的滴度位于檢測限度以下（圖6A）。為檢測呼吸道黏膜的抗體水平，研究人員檢測了肺泡灌洗液（BAL）的抗體滴度，RBD-OMV組中可檢測到IgG/IgM/IgA，兩個對照組則未檢測到。中和抗體測試表明，WT病毒株感染的抗體滴度與14天開始上升，于28天達到峰值并可保持到35天（圖6F）；抗體的中和活性在Delta和WT中沒有顯著差異（圖6G）。
圖7A：肺部組織中的病毒滴度；B：BAL中的病毒滴度
TCID50檢測結果顯示，肺部組織（圖7A）和BAL（圖7B）中RBD-OMV組病毒滴度顯著低于兩個對照組，BAL組已達到檢測最低限度。
圖8 A：Day48不同組別倉鼠的肺部形態；B&C：H&E染色結果及病變積分。
于48天處死倉鼠并分離肺部，肉眼觀察可見RBD-OMV組的炎癥和出血病灶少于兩個對照組，具有更少的肺泡水腫（圖8A）；肺組織切片的H&E染色結果也顯示，RBD-OMV組的炎癥、出血病灶和肺泡萎陷更少，且雄性的病變積分更低（圖8B&C）。
·研究總結·
以上所有檢測結果表明，這種RBD-OMV疫苗可誘導抗體分泌，分泌的抗體能夠中和野生型和Delta亞種病毒，證明了疫苗具有保護作用。OMV等外泌體疫苗具有如下優勢：
? 產量高：細菌復制快，且能夠大量分泌OMV；
? 多功能：表面可修飾多種抗原；
? 組分構成簡單：疫苗不需要其他佐劑；
? 穩定性高：在室溫下也能夠保持穩定，可以凍干粉末的形式在低溫長期保存。
以上結果說明，基于OMV的外泌體疫苗具有廣泛的應用前景，可作為阻斷新冠肺炎以及其他傳染病傳播的有效手段。
在這項研究中，作者使用Exoview系統對結合了重組RBD的OMV進行了表征分析，確定OMV上成功結合了新冠病毒的RBD。Exoview在外泌體疫苗開發中，可快速準確地表征外泌體，并統計不同表型外泌體數量并計算其比例，適合作為多組分外泌體疫苗的標準檢測手段。
·參考文獻·
[1]
Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman, Wouter S.P. Jong, …
& Kenneth W. Witwer.?(2021). A bacterial extracellular vesicle-based
intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease
and?elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and Delta
variant. bioRxiv. .
全自動外泌體熒光檢測分析系統（ExoView R200）簡介
作為外泌體表征分析的倡導者，美國NanoView
Biosciences于2018年推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView，該系統一經推出，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，憑借其穩定、出色的性能，短短幾年在全球已有近百個客戶，發表文獻100多篇。ExoView的精準表征，能夠幫助科學家更深入地了解外泌體與疾病之間的關系，助力疾病診斷和新藥開發。
Nanoview所開發的全自動外泌體熒光檢測分析系統（ExoView
R200）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術，是一款無需純化的全自動的新型外泌體表征設備。該設備能夠提供全方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計數、表型與生物標志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。
為了更好的服務中國客戶；Quantum Design中國子公司在北京建立了專業的客戶服務中心，正式推出專業的全方位外泌體表征測試服務，您只需要少量樣品即可獲得全方位的外泌體表征數據：
外泌體是一類直徑約30-150
nm的細胞外囊泡，可攜帶RNA，DNA，蛋白質、等多種信號分子，是一種新型的細胞間信號傳遞的媒介。在疾病的發生、診斷和治療中發揮著重要的作用。但是對于外泌體進行分析的手段卻非常有限，尤其是在單個外泌體的表征的分析以外泌體內容物分析方面更加缺乏。美國NanoView
Biosciences推出的全自動外泌體熒光檢測分析系統—Exoview
R200，采用了全新的SP-IRIS技術，實現了對單個外泌體的全面表征，包括了外泌體的熒光成像、亞群粒徑檢測、計數、內容物分析、蛋白共定位等。短短三年，在世界范圍內已有多家實驗室采用該設備，包括了著名的哈佛大學、約翰霍普金斯大學、康奈爾大學、洛杉磯兒童醫院、麻省總醫院、東京工業大學、首爾大學、新加坡國立大學、大阪大學等，發表文獻近百篇，其中不乏頂級期刊如Cell、Nature、Journal
of Extracellular Vesicles、CancerResearch、Nanoscale、ACS Nano、BMJ
journal、Brain, Behavior, and Immunity、Trends in Cancer等。
2021年，Quantum Design中國將Exoview R200引入中國，為國內科研工作者提供了多層次和全面的外泌體表征解決方案，同時也被生物通評為“2021生命科學十大創新產品”。
本次報告內容豐富，包括了目前外泌體研究過程中遇到的困難及挑戰，常規的檢測方法及其限制，外泌體前沿的進展及ExoviewR200如何助力科研工作者取得更加突出的研究成果。
Exoview R200能夠幫助您實現：
? 可對單個外泌體進行無標記和熒光成像
? 無需純化，避免對外泌體損傷造成檢測誤差
? 一次性輸出外泌體相關的亞群粒徑、亞群絕對計數、蛋白共定位、蛋白熒光強度與粒徑對比分析等數據
? 高通量檢測
? 同時對外泌體表面蛋白和內容物進行分析
2022年3月11日 ?10:00
胡西，首都醫科大學博士，加州大學洛杉磯分校博士后，研究期間主要從事干細胞誘導和神經細胞分化及ALS相關病變研究。2018年加入Quantum
Design中國子公司，任生物部應用科學家，主要負責光學成像類設備的應用技術支持工作，具有豐富的電鏡、高級顯微鏡操作和成像經驗。
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