小細胞外囊泡 (sEV) 是由活細胞分泌的具有天然納米級磷脂雙層結構的小囊泡。sEV 被認為是一種天然載體，用于將蛋白質、脂質和核酸等成分從供體細胞輸送到受體細胞，從而實現不同距離的細胞通訊。sEV 廣泛用于組織再生，靶向藥物輸送,生物治療和液體活檢,具有非常廣闊的應用前景。

原標題Preservation of Small Extracellular Vesicle in Gelatin Methacryloyl Hydrogel Through Reduced Particles Aggregation for Therapeutic Applications，作者Kelun Wu等來自四川大學華西口腔醫學院口腔疾病國家重點實驗室、國家口腔疾病臨床研究中心、口腔再生醫學國家工程實驗室。

對于治療應用，分離的 sEV 的有效保存已成為一個問題。sEV 已通過幾種主要的保存方法進行保存，包括冷凍保存、凍干和噴霧干燥。毫不奇怪，這些基于傳統細胞冷凍保存或藥物保存的方法也有局限性，包括對低溫（-20° C，-80°C 或 -196°C) 和設備，運輸不便，操作步驟復雜，保存效果不穩定，凍融循環損壞以及冷凍保護劑和凍干保護劑難以去除。

因此，尋找一種高效、便捷、低成本的隔離sEV保存方法非常重要。sEV 是由蛋白質、核酸和脂質包裹的膜結構囊泡。在 4°C 時，完整膜結構中的蛋白質、核酸和脂質相對穩定。sEV 的制備可以被認為是一種膠體– 懸浮有納米級分散顆粒的溶液，sEV 在溶液中進行不規則的布朗傳輸并因此彼此聚集，導致膜結構破裂及其內容物失活而沒有膜結構的保護。

因此，保存在磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的 sEV 的活性在 4°C 下僅幾天后就會顯著降低。我們假設如果可以通過限制 sEV 的移動來減少 sEV 的聚集，可以實現sEV的有效保存，也可以減少凍融循環過程對sEV的損害。

水凝膠是極親水的凝膠，具有三維網絡結構。近年來，許多研究發現，在水凝膠中加載 sEV 可以有效維持體內 sEV 的釋放。水凝膠中的 sEV 在長達 1 小時的時間內緩慢釋放到周圍組織中，不同天水凝膠釋放的 sEV 仍然具有相同的結構。

許多水凝膠交聯后的孔徑在 10-40 nm 之間。這可以有效限制 sEV 的運動并滿足我們對 sEV 保存的要求。明膠甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝膠是通過將甲基丙烯酸酐 (MA) 接枝到明膠分子鏈上來合成的。

它可以進行溫度敏感的物理交聯（可逆）和紫外線 (UV) 敏感的化學交聯（不可逆）。GelMA 水凝膠在GelMA 水凝膠在 4°C 時呈凝膠狀態，在室溫下逐漸變為液態，GelMA 水凝膠的一些基本特性與天然細胞外基質 (ECM) 非常相似，使其與 sEV 具有生物相容性。

GelMA 水凝膠還可以使用不同的方法進行微加工，包括微成型、光掩模、生物 3D 打印、自組裝和微流體技術，以生成人工設計的結構，具有非常廣泛的應用前景。最近的研究證實了加載在 GelMA 水凝膠中的 sEV 對骨軟骨缺損再生的功效。

該研究將脂肪組織來源的 sEV 包裹在 GelMA 水凝膠中，限制了 sEV 的隨機運動并減少了 sEV 的聚集，從而實現了 sEV 在 4°C 下的長期保存，并通過實驗證實保存的這種方法的 sEV 與新鮮 sEV 具有相似的治療效果。保存后的 sEV-GelMA 復合物表現出很強的血管生成能力，并通過調節 UV 交聯時間實現了 sEV 在體內的可控釋放，顯示出巨大的治療應用前景。

圖 1 GelMA 水凝膠中 sEV 保存的示意圖。PBS 中的 sEV 以隨機模式連續移動導致粒子聚集，從而導致膜破裂（左）。GelMA水凝膠可以有效限制sEV的運動并減少聚集以有效保護sEV。分離保存的 sEV 用于體外功能評估，并采用紫外交聯 sEV-GelMA 復合系統比較保存的 sEV 和新鮮 sEV 在體內的生物學功能（右）。

目的：小細胞外囊泡（sEV）在細胞間通訊中發揮著不可替代的作用。然而，溶液中的sEV在保存過程中會相互聚集，導致sEV的結構、內容和功能受損。因此，需要開發一種將高回收率、低成本、方便和易于運輸于一體的最佳保存方法。在這項研究中，通過減少 sEV 顆粒聚集，開發了一種不同于冷凍保存或凍干的新保存策略。

方法：將 sEV 在 4°C 下封裝在熱響應性明膠甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝膠中，以減少可逆交聯過程中的顆粒聚集。sEV 運動在不同介質中可視化，并將保存 28 天的 sEV 的顆粒數量、大小、結構和蛋白質與新鮮 sEV 進行比較。分離人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 和大鼠脂肪來源的基質干細胞 (rASC)，并與新鮮和保存的 sEV 一起培養以測試細胞反應。采用小鼠皮下模型檢測保存的sEV的控釋和血管生成能力。

結果：通過粒子軌跡可視化，GelMA 水凝膠顯著降低了 sEV 運動。在 GelMA 中 4°C 保存 28 天后，sEV 的顆粒數量、大小、結構和蛋白質與新鮮 sEV 相似。在體外，保存的 sEV 具有與新鮮 sEV 相同的促進細胞增殖、遷移和血管生成的能力。在體內，保存的 sEV-GelMA 可以人為地調節 GelMA 水凝膠的吸收率和控制釋放的 sEV 用于治療應用，并且封裝在 GelMA 中的保存的 sEV 顯著促進了小鼠的血管生成。

結論：結果表明，封裝在 GelMA 中的 sEV 可能是一種長期保存 sEV 用于治療應用的新策略。