肝病診治 | 探索4項細胞外囊泡與肝病研究進展

肝炎影響的重要影響，需要解決甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和乙肝感染者在診斷、治療、疫苗接種、投資、政策和社會接受方面的差距。世界衛生組織的最新數據，我國的丙型肝炎的感染率為2.2%，大約有近3000萬HCV感染者。同時我國目前存在約9000萬乙肝攜帶者，2800多萬乙肝患者，位居全球首位。

鑒于肝病的高發病率和對侵入性肝活檢的診斷的嚴重依賴，迫切需要在這一臨床領域取得進展。隨著干細胞和外泌體技術的進步，研究探索了細胞外囊泡 (EV) 作為病毒性肝炎和其他肝病診斷生物標志物的效用十分必要。在這里我們探討了研究人員如何將細胞外囊泡作為改善肝炎患者預后的一種方式。

基于 細胞外囊泡（EV）診斷非酒精性脂肪肝和慢性丙型肝炎的早期進展

論文：Kornek M et al (2012). Circulating microparticles as disease-specific biomarkers of severity of inflammation in patients with hepatitis C or nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 143(2)448-458. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2012.04.031

這是一篇開創性的論文，表明循環免疫細胞 EV 的量化可用于評估與慢性肝病相關的肝臟炎癥的程度和特征。

背景：丙型肝炎和非酒精性脂肪肝（NAFLD）是兩種嚴重且高度普遍的肝臟疾病。丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒引起的傳染病，影響著全世界約 7100 萬人。丙型肝炎被稱為“無聲疾病”，通常在發生重大肝損傷之前未被發現。

NAFLD 由一系列以肝臟脂肪過多為特征的慢性肝病組成。這種疾病可以表現為良性脂肪變性，也可以發展為更嚴重的形式：非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，它與嚴重的炎癥、纖維化和肝細胞損傷有關。目前，肝活檢是疑似 NASH 患者的診斷金標準。

與慢性丙型肝炎與顯著的 CD8+ 和 CD4+ T 細胞浸潤相關的知識相一致，該小組先前已經表明，來自 CD4+ 和 CD8+ T 細胞的循環 MP 在慢性丙型肝炎患者中升高，并且這些水平相關具有組織學嚴重性。

研究方法：科學家Kornek 等人比較了不同群體的循環細胞膜衍生微粒 (MPs) 的概況：健康志愿者、慢性丙型肝炎患者和不同嚴重程度的 NAFLD 患者。研究了一組擴展的 MP 表面標志物，包括來自單核細胞/巨噬細胞和骨髓樹突細胞、中性粒細胞、血小板和內皮細胞以及不變的自然殺傷 T 細胞的標志物。

主要發現：在不同組中發現了 MP 特征的獨特差異。與健康個體相比，慢性丙型肝炎患者血漿中 CD4+ 和 CD8+ T 細胞衍生的 MPs 升高。雖然這些 MPs 無法區分慢性丙型肝炎組與 NAFL/NASH 組，但與慢性丙型肝炎患者相比，NAFL/NASH 患者的 CD15+ 和 CD41+ 的 MPs 顯著降低。與 CD14+ 和 iNKT 細胞是作為脂肪組織炎癥的核心，具有這些標志物的 MPs 在 NAFL 組中呈特征性升高，并且在組織學嚴重 NASH 的患者中進一步升高，但在慢性丙型肝炎患者中則沒有。

建立從含有 EV 的樣本中去除病毒粒子的技術

論文：Jung S, Jacobs K, Shein M, et al. (2020) Efficient and reproducible depletion of hepatitis B virus from plasma derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10(2)e12040. https://doi.org/10.1002/jev2.12040

在這份技術報告中，Jung 等人?描述了一種從含有乙型肝炎病毒的血漿中純化 EV（無結合抗體）的方法。該方法有可能用于從其他病毒樣本中分離出無病毒的 EV。

背景：乙型肝炎仍然是全球健康負擔，其病理生理學知之甚少，是肝癌的主要原因。雖然在消除乙型肝炎這一公共衛生威脅方面取得了重大進展，這主要歸功于疫苗的開發，但乙型肝炎感染影響了超過 2.5 億慢性攜帶者，每年造成近 900,000 人死亡。由于 EV 幾乎涉及所有生理過程，因此 EV 領域熱衷于探索 EV 如何導致病毒感染——包括乙型肝炎。

含有 EV 的樣品的純化是 EV 和病毒感染功能研究的重要一步，因為它確保被測量的顆粒實際上是 EV。為了促進對 EV 及其在病毒感染中的作用的研究，首先需要從含有 EV 的樣品中去除病毒和抗體污染物。然而，EV 與病毒體的分離具有挑戰性，因為它們在大小、密度和膜組成上可能重疊。

研究方法：科學家Jung 等人建立了使用 Izon 的 qEVoriginal 柱從含有乙型肝炎病毒的血漿中純化 EV 的方案，然后進行基于親和力的純化。簡而言之，血漿與抗 HBsAg 一起孵育，qEV 柱用于去除未結合的抗 HBsAg、血清雜質和大部分 HBV 病毒粒子。結合使用基于親和力的純化，該協議導致 EV 制劑中的抗 HBsAg 結合顆粒（例如病毒粒子和細絲）完全耗盡。

主要發現：qEV 色譜柱與基于親和純化的組合確保了 EV 樣品的純度，不含病毒大小的顆粒、乙型肝炎表面抗原和核心抗原、抗體污染和感染潛力。

探索肝細胞癌的生物標志物：區分游離蛋白與外泌體生物標志物

論文:Easom N, Marks M, Jobe D,?et al.?(2020). ULBP1 is elevated in human hepatocellular carcinoma and predicts outcome.?Frontiers in Oncology. 10:971. doi: 10.3389/fonc.2020.00971

背景：肝細胞癌（HCC）是全球第三大癌癥死亡原因。最常見的根本原因是乙型肝炎，其次是丙型肝炎和其他肝臟疾病。這項研究檢查了參與潛在可藥用癌癥途徑的受體的配體（自然殺傷細胞組 2 受體 D，NKG2D）。

研究方法：這項研究的重點是一種稱為 ULBP1 的結合蛋白（和 NKG2D 配體），它由經歷病毒感染的細胞表達。為了了解循環 ULBP1 的性質，Easom 等人。（2020）比較了 ULBP1（一種 NKG2D 配體）在外泌體中的濃度以及作為游離蛋白在 HCC 患者循環中的濃度。這是通過比較 Izon 的 qEV 色譜柱分離的血清來實現的。

主要發現：與肝硬化患者或健康對照組相比，HCC 患者血清中的 ULBP1 濃度升高——突出了 ULBP1 的診斷潛力。ULBP1 不是與外泌體結合，而是主要以游離蛋白的形式存在。

研究細胞外囊泡中的 miRNA 作為酒精相關肝損傷的標志物

Paper: Eguchi A, Franz N, Kobayashi Y?et al.?(2019). Circulating extracellular vesicles and their miR “barcode” differentiate alcohol drinkers with liver injury and those without liver injury in severe trauma patients.?Frontiers in Medicine?6: Article 30

背景：酒精性肝炎是一個主要的健康問題,嚴重肝損傷的眾多影響之一是它與促炎反應有關——這是在急診科治療患者時特別關注的問題。由于對歷史酒精濫用的迅速識別可以在臨床上挽救生命，因此開發用于評估醉酒創傷患者肝損傷的非侵入性工具是令人感興趣的。為此Eguchi等人開展了一項研究，以檢查 EV-microRNA 是否反映了酒精中毒創傷患者的肝損傷。

研究方法：Eguchi等比較了循環 EV 中一組 microRNA 的表達水平，用 qEV 柱分離，在不同組中：不飲酒者、肝損傷飲酒者和無肝損傷飲酒者。與患者結果一起比較和分析了 microRNA 面板。

主要發現：EV 濃度和特定 EV-miRNA 的表達水平由受損肝細胞釋放，并與血清膽紅素相關，為 EV 可用于識別創傷患者飲酒行為的假設提供支持。

促進病毒學研究進步的純化技術

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將 EV 或病毒顆粒分離到高純度和高濃度對其研究至關重要。正如此處和其他地方所強調的 ，獨立小組已經表明，與其他方法（例如超速離心）相比， qEV 色譜柱去除污染物的程度更大。高效、基于 qEV 的 EV 和病毒顆粒分離在推進重要的 EV 和病毒學研究方面發揮著重要作用，例如此處重點介紹的肝炎相關研究。

References

1. World Health Organization. Hepatitis C. Who.int. Published July 18, 2018. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c

2. Gunn NT, Shiffman ML. The Use of Liver Biopsy in Nonalcoholic Fatty Liver Disease.?Clinics in Liver Disease. 2018;22(1):109-119. doi:10.1016/j.cld.2017.08.006

3. Kornek M, Popov Y, Libermann TA, Afdhal NH, Schuppan D. Human T cell microparticles circulate in blood of hepatitis patients and induce fibrolytic activation of hepatic stellate cells.?Hepatology. 2010;53(1):230-242. doi:10.1002/hep.23999

4. McNamara RP, Dittmer DP. Modern Techniques for the Isolation of Extracellular Vesicles and Viruses.?Journal of Neuroimmune Pharmacology. 2019;15(3):459-472. doi:10.1007/s11481-019-09874-x